胶体金标记蛋白A技术.pdfVIP

中国试剂网 3.15.2.28 胶体金标记蛋白A 技术（Protein A-gold technique, PAg 法） PAg 复合物制备方法简便，作为第二抗体，无种属特异性，可以免去不同种属动 物要制备不同的特异性免疫球蛋白。PAg 复合物与包埋剂和细胞成分都极少发 生非特异性的交互作用，蛋白A 和金粒间非共价的结合特性既不影响蛋白A 的 活性，又能保持高度的稳定性，PAg 复合物分子最小易于穿透组织。PAg 复合物 的原液在4 ℃可保存达一年之久。电镜水平的PAg 染色法 PAg 法在电镜技术的 应用原则是二步标记法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要区别于一般胶体金 免疫染色在：①须1%卵白蛋白－PBs （pH7.4 ）或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris 缓冲液（pH7.4 ）来封闭非特异性的结合部位，而不是采用羊或其它的动物的正 常抗血清，因为PAg 复合物能够与正常血清组中的Ig 结合，从而给出假阳性结 果；②在应用第一抗血清孵育和PBS 冲洗后作第二抗血清即PAg 复合物孵育前 的准备时，应用的PBS 或TBS 的pH 应变更为pH8.2 。其它可参照本节中包埋后 染色法进行。 液体配制： 1、 胶体金稀释液配方： （PH ＝8.2 ）的0.02mo1 ／L Tris TBS 缓冲液，加入试剂级卵清白蛋白至1％。｛免 疫电镜按1：20-50 稀释，淡红色为适宜稀释液,胶体金稀释后应于当天使用，未 用完的应该丢弃。（免疫胶体金说明书）｝ 2 、 清洗液： pH7.4 Tris-Hcl 缓冲液：Tris，60.57g，1mol ／L Hcl 约420m1 ，调pH 0.5mol ／L ， 值至7.4，最后加双蒸水至1000m1，此为储备液。 0.05mo1 ／L Tris 缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；0.5mo1 ／L ，pH7.4 Tris-Hcl 缓冲 液100m1；加双蒸水至1000m1，调pH 值至7.4 。 0.02mo1 ／LTris 缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；o.5mo1 ／L ，pH7.4 Tris-Hcl 缓冲 液40m1 ，加双蒸水至l000m1 ，调pH 值至8.2。 3、 H2O2 的配制:3% H2O2 4 、 8 ％过碘酸钠水溶液 5、 封闭液： 前封闭液：1%卵白蛋白—0.05mo1 ／LTris 缓冲液（pH7.4 ）； 中国试剂网 3.15.2.28 后封闭液以及胶体金稀释液：1%卵白蛋白—0.02mo1 ／LTris 缓冲液（pH8.2 ）， 后封闭为胶体金结合作准备。 具体操作: 一、包埋：常规电镜制样，样品只需要戊二醛固定，不需要锇酸后固定。丙酮梯 度脱水时70 ％的丙酮中没有添加染色剂。样品于37 度烘箱中固化。 二、切片： 超薄切片厚50～70nm 左右，载于300 网孔的镍网上。 三、抗原修复： 1、置1%H2O2 内10min 至1h （视树脂的硬度和切片的厚度而定），以去锇酸和 增进树脂穿透性，有利抗体进入。如切片很薄或于低温包埋时，此步可省略。操 作时，滴入 1%H2O2 液 1 滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上。对中枢神 经系统切片，有主张以1%过碘酸钾（KIO4 ）代替H2O2 的。 （同时用8 ％过碘酸钠水溶液代替双氧水，室温5～25 分钟以及丙酮对环氧树脂 进行溶解。看三者那个效果最好） 2 、双蒸水洗3 次，每次10min，第1，2 次浮于液滴上清洗，第3 次以盛双蒸水 的注射器沿镍网面冲洗，水流应有适当压力，但不宜过高强，用滤纸在网缘将水 吸干。(0.05mo1 ／L TBS pH7.4 洗5min ×3 次?) 三、封闭以及免疫反应： 1、载有超薄片的镍网或金网浮于1%卵白蛋白－TBS （7.4 ）液滴上，室温约1h， 阻断非特异性吸附，吸去多余血清，不洗。 2 、载网直接移至第一抗血清液滴上(抗体稀释度较常规免疫组化低l 倍) ，在室温 孵育2h 或4 ℃18～24h 。 3、0.05mo1 ／L TBS pH7.4 ，洗5min ×3 次。0.02mo1 ／L TBS PH