肝糖原地提取、鉴定与定量-第七实验室.docVIP

实用标准 文案大全 南方医科大学 南方医科大学 生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 FORMTEXT Folin-酚试剂法测定蛋白质含量 实验日期 实验地点 合作者 指导老师 评分 教师签名 批改日期 格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。 一、实验目的 1、学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法；? 2、学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法； 3、学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式； 4、正确掌握使用离心机的方法步骤； 5、熟练运用溶液混匀的各种方法； 6、正确掌握溶液转移的操作； 7、正确掌握使用分光光度计的方法步骤 二、实验原理 实验1 肝糖原的提取与鉴定 糖原是生物的主要储能物质之一，主要储存与肝细胞中，采用研磨匀浆等方法可以使肝细胞破碎。肝细胞破碎，细胞内容物流出。低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶并且使蛋白质沉淀，糖原则能够稳定地保存在上清液中，从而达到分离糖原与蛋白质等其他成分的目的。糖原不溶于乙醇但可溶于热水，故可以先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。此外，糖原还可以被酸水解成葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可以判定肝组织中糖原的存在。糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min后会出现砖红色沉淀。 CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)2↓ 2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH +氧化型葡萄糖+ H2O 2CuOH = H20 + Cu2O↓ (红色) Cu(OH)2 ==== H2O + CuO↓ (黑色) 实验2 肝糖原定量测定 糖原在浓碱溶液中非常稳定，故可将肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，保留肝糖原。糖原可以被浓酸水解成葡萄糖，而浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成5-羟甲基呋喃甲醛，该化合物与蒽酮脱水缩合可以生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10-100μg，溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比。利用该反应原理处理标准葡萄糖溶液，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。 三、材料与方法：以流程图示意 1、实验材料 （1）肝糖原的提取与鉴定 样品：1.50g的鸡肝 试剂：5%三氯醋酸溶液、95%乙醇、蒸馏水、浓HCl溶液、50%NaOH溶液、碘试剂和班氏试剂 仪器和器材：离心机、天平、试管、试管架、研钵、玻璃棒、室温-100℃恒温水浴箱、剪刀、镊子、刻度吸管、加样枪和白瓷反应板 （2）肝糖原的定量测定 样品：0.15g的鸡肝 试剂：30%KOH溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液和0.2%蒽酮溶液显色剂 仪器和器材：室温-100℃恒温水浴箱、比色皿、100ml容量瓶、分光光度计、试管、剪刀、镊子、刻度吸管和微量加样枪 3、实验步骤与方法 （1）肝糖原的提取与鉴定： 鸡肝约1.5g,剪碎 鸡肝约1.5g,剪碎 +1ml 5% 三氯醋酸，研磨至乳状 +3ml 5%CCl3COOH三氯醋酸，研磨成肝匀浆 +3ml 5%CCl3COOH三氯醋酸，研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心5min(4000r /min ) 上清液(取2ml)沉淀（弃去）加碘试剂2滴加碘试剂2滴糖原溶液2滴糖原水解液糖原水解液2滴呈色对比 上清液(取2ml) 沉淀（弃去） 加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 糖原溶液2滴 糖原水解液 糖原水解液2滴 呈色对比 +班氏试剂4滴 +浓HCl 5滴 沸水浴15min,冷却 +50%NaOH 5滴 +2 +2ml 95%乙醇，混匀，静置10min 离心 离心5min(4000r/min ) 沉淀上清液（弃去） 沉淀 上清液（弃去） 沸水浴 沸水浴2min,溶解沉淀 糖原溶液1ml白瓷板孔穴中 糖原溶液1ml 白瓷板孔穴中 +50%NaOH 5滴沸水浴15min,冷却+浓HCl 5滴+班氏试剂4滴糖原水解液2 +50%NaOH 5滴 沸水浴15min,冷却 +浓HCl 5滴 +班氏试剂4滴 糖原水解液2滴 糖原水解液 混匀 加碘试剂2滴 加碘试剂2滴 蒸馏水2滴 加碘试剂2滴 糖原溶液2滴 呈色对比 呈色对比 沸水浴 沸水浴2min,观察变化 图一：肝糖原的提取与鉴定实验流程 （2）肝糖原定量测定 冷却，全部转入100 ml容量瓶中沸水浴 冷却