介导破骨细胞生成的新信号转导蛋白及骨髓瘤骨病新治疗靶点的初步探索-内科学(血液病)专业论文.docx

广州医科大学 广州医科大学 介导破骨细胞生成的新信号转导蛋白及骨髓瘤骨病新治疗靶点的初步探索 万方数据 万方数据 介导破骨细胞生成的新信号转导蛋白及 骨髓瘤骨病新治疗靶点的初步探索 博士研究生：王顺清 导 师：毛 平 教授 专 业：内科学（血液病学） 广州医科大学附属广州市第一人民医院血液内科 中文摘要 目的： 多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）患者 RANKL 表达异常增高使 RANKL/RANK 信号系统过度激活，导致破骨细胞（Osteoclast，OC）大量生成 且功能亢进在骨髓瘤骨病（Myeloma bone disease，MBD）的发生、发展中起关 键作用，因此抑制 RANKL/RANK 信号转导途径从而抑制 OC 的形成及其破骨 功能是治疗 MBD 有效方法之一。我们先前的研究发现 RANK 蛋白上存在一个 新基序：IVVY，介导了一条 OC 形成所必需的新信号转导途径。本研究的目的 就是要利用这个全新的 RANK 基序，寻找和鉴定出与新基序 IVVY 相互作用而 且介导破骨细胞生成的、目前尚未知的下游信号转导蛋白，以进一步揭示 RANKL/RANK 系统激活引起破骨细胞形成的细胞信号转导途径（signaling pathway）。那么，这一信号转导途径及其信号转导蛋白很大可能就是 MBD 等 骨病的特异性治疗靶点，为研究和开发治疗 MBD 特异性靶向药物奠定基础。 研究内容和方法： 1. 采用 Gateway 技术构建适合酵母表达的小鼠巨噬细胞 cDNA 文库并进行 鉴定 2. 酵母双杂交实验扫库以筛选与 IVVY 相互作用的候选下游信号蛋白 3. 与 IVVY 相互作用的候选蛋白在破骨细胞中表达情况验证 1 利用 Western Blotting 技术和激光共聚焦扫描显微镜检测相应蛋白表达的定 量、定位及其动态分析。 4. IVVY 基序与筛选到的候选蛋白相互作用的验证 分别利用酵母双杂交和免疫共沉淀（coimmunoprecipitation, coIP）实验在 酵母细胞和哺乳细胞 293T 中验证上述筛选到的候选蛋白与诱饵蛋白 Bait 之间 的相互作用；另外，将诱饵蛋白 Bait 上的 IVVY 基序突变成 IVAF 以形成突变 体 Bait，再重复上述酵母双杂交和 coIP 实验，来证明候选蛋白是经 IVVY 基序 与 RANK 相互作用。 5. 与 IVVY 相互作用的候选蛋白介导破骨细胞生成的功能鉴定 利用 RNAi 技术抑制巨噬细胞内这一候选蛋白的表达，以及 siRNA 解救技 术抵消这一 RNAi 作用，观察这一蛋白被抑制后及解救后的巨噬细胞形成破骨 细胞的能力和水平，从而考察这一蛋白是否具有介导破骨细胞形成的功能，从 功能上进一步证实这一与 IVVY 基序相互作用的蛋白为介导破骨细胞形成的 IVVY 基序下游信号转导蛋白。 6. RYBP 介导破骨细胞形成的结构域和机制研究 利用 coIP、ChIP 、siRNA 及其解救技术来鉴定 RYBP 上介导破骨细胞形 成的结合结构域和功能结构域，以及 RYBP 介导破骨细胞形成的表观遗传学机 制。 结果： 1．成功构建了小鼠巨噬细胞cDNA酵母表达型文库 文库总滴度达到3.9×107，酶切分析24个克隆，23个（95.83%）克隆有肯定 的基因插入片段，插入片段大小范围为0.2-5.6Kb，平均为2.27 Kb，证实此BMMs cDNA表达型文库质量高，达到标准文库的要求。 2．酵母双杂交技术筛库，成功筛选出最具可能性的候选蛋白RYBP 3轮酵母双杂交试验，筛得10个阳性克隆的质粒，经测序分析发现，其中有6 个是相同的，其基因库编号（GB）是BC080287，编码Ring1和YY1结合蛋白（Ring1 and YY1-binding protein，RYBP），其出现的几率最高，意味着它是可能性最大的 候选蛋白。另外3个筛选到的蛋白为：编码ATP结合盒（ATP-binding cassette）、 编码E2F转录因子（E2F transcription factor)和热休克蛋白8 (heat shock protein 8) 2 的基因。而且，回头检查实验结果也发现，表达RYBP蛋白的阳性克隆出现也最 快。 3．RYBP在破骨细胞形成过程中的表达及变化情况 在M-CSF和RANKL的刺激下，在骨髓巨噬细胞（BMMs）向破骨细胞分化 过程中，Western Blotting 检测细胞内RYBP的表达量变化不大，但激光共聚焦扫 描发现RYBP出现一个“从细胞核移动到细胞膜再又回到细胞核”的细胞内转移 过程，提示RYBP在破骨细胞形成过程中发生着变化，很可能与破骨细胞形成密 切相关。 4．酵母细胞内验证 RYBP与RANK蛋