核酸检测培训.ppt

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核 酸 检 测 北京万泰研发中心 2010.04.12 主要内容 为什么要做核酸检测? 核酸是什么? 怎样进行核酸检测? 市场状况 为什么要做核酸检测? 核酸检测(基因检测) 现知人类的疾病都与基因有直接或间接 的关系。医学实验室所要检测和分析的核酸 既包括人体本身的基因(DNA ) 以及反映基因 转录水平的mRNA , 也包括侵入人体的致病 微生物等所携带的外源性基因(DNA/RNA )。 传统检测试剂(酶免ELISA) 技术特点: 检测目标为蛋白, 所检测的主要是疾病所引发的人体抗体而不是病原体本身,是一种间接、滞后的检测方式。易操作,成本低。 固有不足: 不能够消除对“窗口期”标本(抗体阴性,核酸阳性)的漏检 难于检测病原体的不同亚型及突变型 不典型血清阳转 对免疫逃避或免疫沉寂的标本产生漏检 核酸检测 显著缩短窗口期:HIV窗口期缩短45%,HCV缩 短89%,HBV缩短50%。 提 高 灵 敏 度:理论上扩增体系中单拷贝的模板 也能被检测出。 特 异 性 好:使用荧光探针技术的PCR检测, 几乎没有方法学的假阳性。 直接揭示病原体的存在 对操作者及检测环境的要求较高 检测成本相对较高 输血中可传染病原体的“窗口期” 窗口期检测率 核酸检测在临床诊断中的应用 定性诊断 血液筛查 病原体筛查诊断 SNP和耐药突变诊断 基因型分型 遗传病诊断 个体用药诊断 基因鉴定和配型 …………… 核 酸 是 什 么? 核酸(Nucleic Acid)是一种主要位于细胞核内的生物大分子,其充当着生物体遗传信息的携带和传递。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。 现已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构有关。肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。 核酸分类:DNA、RNA; DNA:dATP(A)、dTTP(T)、 dCTP(C)、dGTP(G); RNA:ATP、UTP、CTP、GTP; 3’?5’磷酸键 DNA结构 单链DNA形成双链的原则— 碱基互补配对: G-C T-A 核酸在体内的复制 DNA的热变性 怎样进行核酸检测? 核酸检测的一般流程 核酸样品的制备: 从血液、体液、组织中提取或PCR扩增 样品的检测: 核酸杂交、PCR、荧光定量PCR、PCR-ELISA等 结果判读: 电泳、膜、荧光定量PCR仪等 核 酸 杂 交 核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开,而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行,因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交(Southern blot hybridization )和RNA印迹杂交(Northern blot hybridization)。 PCR 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。 DNA的复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 市 场 状 况 现状和趋势 1、现状:公司多、竞争激烈、同质化;手工操作为主;缺乏规范;核心技术少; 2、趋势:管理部门逐渐加强管理,相关标准制订中;进口试剂以全自动诊断平台为主在国内推广,国内厂家渐进推出自动化核酸提取仪器进入市场; 实时荧光PCR检测的难点 1、大规模适合自动化核酸提取的样品制备技术 2、适合筛查应用的多重PCR技术 3、高通量全自动的核酸提取设备和耗材 4、高通量检测设备和配套耗材的成本控制 5、质量控制和质量管理方法 6、核心原料的成本控制 试剂质量控制方法 1、实验室分类和功能化 2、人员培训和自我约束 3、建立切实可行的质量控制方法 和管理体系 TaqMan探针法 TaqMan法优

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