高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法HRM技术应用.docVIP

高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法一HRM技术应用 HRM介绍 HRM技术是high-resolution melting analysis即高分辨熔解曲线分析技 术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。基于高 效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探 针，在PCR结朿后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核昔酸多态 性?SNP、甲基化、HLA配型等的分析。 因操作简便快速，使用成木低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。 HRM原理 HRM的主要原理是根据DNA序列的长度,GC含量以及碱基互补性差界, 应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分 辨精度达到对单个碱基差异的区分。随着高精度PCR仪(LightCycler? 480 和 Rotor-Gene 6000 )和饱和染料(LC Green、Eva Green 等)的出现，H RM技术的普及使用成为可能。 HRM应用 ?SNP （单核甘酸多态性）的筛查。 ?基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。 ?新突变的筛杳。 ?甲基化的筛查。 ?遗传育种中特泄突变的筛查、未知突变的发现。 ?HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研 究。 ?法医学鉴定、亲子鉴定。 ?动植物品质相关多态性位点的研究等。植物抗逆性，突变与性状关联性研 究。 HRM特点 ?高通量：1次可同时检测10-384样木，适合大样木、多SNP、多突变 位点及多位点甲基化的扫描。 ?高敏度：肿瘤研究屮低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突 变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞屮1个突变细胞，适用于手术和 其它微量组织中突变检测。检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25% ,即100 个正常细胞中至少^25个突变细胞，测序仅适用手术组织。 ?特异性好：PCR产物无需后续处理，特异性高达100% o直接未知杂合 突变鉴定准确性100%,特界性100% o直接未知纯合突变鉴定准确性96%, 利用非标记探针快速基因分型法直接未知纯合子鉴定准确性100%。 ?重复性好：重复性100% ?使用范围广：不受碱基位点局限，除可检出已知突变外，也能检测出未知 突变。 ?重复性好：样品PCR和HRM分析直接在同一管内进行，实现闭管操作, 避免交叉污染。 ?操作简便：只需设计特异引物，无需序列特异性探针，无需测序，也不受 突变碱基位点与类型的局限。 ?成本低：简化操作时间和步骤，大大降低成本，检测费用远少于测序、T aqman探针技术。 ?标本范圉广：可用于新鲜或酒精固泄、石蜡包埋的手术标本，也可用于微 量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。传统“PCR+ 测序”方法难以检测大部分不能手术的患者。 ?其它：只检测PCR样品中荧光强度的变化，不消耗任何PCR样品，无 污染，PCR产物可以进行下游分析，非常适合于测序前的SNP、甲基化等预扫 描筛查O HRM应用举例 ? SNP检测单核昔酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs ),指单个核昔 酸碱基的改变，包括置换、颠换、缺失和插入，导致的核酸序列的多态性。在不 同个体的同一条染色体或同一位点的核甘酸序列中，绝大多数核甘酸序列一致而 只有一个碱基不同的现象，这就是SNP。SNP在人类基因组中数量较多，发生 频率较高，因此被认为是继微卫星之后的新-?代遗传学标记。 HRM检测SNP技术是依据在一定的温度范帀内将PCR扩增的产物进行变 性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每 一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA 指纹图谱一样，具有很高的特界性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型 纯合子、杂合子和突变性纯合子(下图)。 lnivhdldg ami lnivhdldg ami 检测SNP的方法有很多种。成本较低、通量较大的方法大都局限于己知、特泄 位点，如Taqman探针法。既要对已知位点分析又要查找未知位点，一般采用 PCR+测序的方法，成木高、操作繁复较低。 HRM技术是一种低成本、高通量、快速，且不受位点局限的检测方法，是SN P筛查的最佳选择。 SNP检测方法比较 研究方 法 优点 缺点 直接测 序法 SNP分析的金标准能发现已知 和未知SNP位点 每个位点均需要经PCR扩增，然后测 序，成木较高，工作量大，周期特别长， 价格昂贵，不适合大样本做疾病关联分 析，且容易交叉污染。 Taqma n探针 法 适合已知SNP位点、位点数量 少、通量高的检测 价格昂贵（探针合成费用高），不能同 时发现未知SNP位