5种制备siRNAs的方法_首都师范大学精品课程网.pptVIP

siRNA design RNAi 用途 5种制备siRNAs的方法： 体外制备： 化学合成 体外转录 用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA ??? 体内表达： siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达 1. 化学合成 high quality, chemically synthesized siRNAs on a custom basis. the large yield of high purity siRNA obtained. most expensive Best for: 已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究 Not suitable for: 筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素 体外转录是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。 这个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果 Best for: 筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 Not suitable for: 实验需要大量的，一个特定的siRNA，长期研究。 2. 体外转录 选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA? RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一众siRNAs 除掉没有被消化的dsRNA siRNA混合物直接转染细胞 3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 体内表达 采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。 siRNA表达载体 siRNA表达框架 (SECs) siRNA表达载体 多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种 siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞。 siRNA表达框架 (SECs) siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到。 RNAi可以直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的。例如在抗肿瘤治疗中， RNAi可用于抑制癌基因的表达；或者利用RNAi的高度特异性敲除点突变激活的癌基因；也可用于抑制基因扩增或抑制融合基因表达；还可用于抑制其他与肿瘤发生发展相关基因（如血管内皮生长因子VEGF或多药耐药基因MDR）的表达。在治疗病毒性疾病的研究中，可以设计针对病毒基因组RNA的siRNA或针对宿主细胞病毒受体的siRNA来抗病毒。 RNAi 用途 C/EBPs是生物体内重要的转录因子， 迄今已报道的C/EBPs有6 类，其中，人类的C/EBPβ 又称NF-IL6，是C/EBPs家族中的一个重要成员。研究发现， NF-IL6 经常在某些肿瘤细胞系如乳腺癌、皮肤癌等中过表达，因此，降低NF-IL6 的表达水平，可能成为肿瘤治疗的重要途径。 采用特异设计的针对NF-IL6 mRNA的siRNA，与能特异表达siRNA片段的质粒进行重组后感染人乳腺癌瘤细胞MCF-7，以研究RNAi 技术能否特异性抑制MCF-7( 中转录因子NF-IL6基因的过表达，从而为肿瘤的基因治疗提供新的方法和实验基础。 构建能够沉默转录因子NF-IL6表达的小干涉siRNA 质粒，转染肿瘤MCF-7细胞后，用Western印迹法和荧光素酶活性实验检测NF-IL6 表达水平和转录活性的改变。结果发现NF-IL6的表达水平被下调80%，转录激活能力降低了60%，转染细胞内部出现大量空洞，细胞增殖停滞。 推测可能是因为NF-IL6基因被抑制后，与细胞增殖及形态维持相关的基因表达失控，从而使MCF-7细胞增殖受到影响，因而预示着对NF-IL6的siRNA 干涉可治疗癌症。