数字PcR方法准确测量质粒DnA拷贝浓度-计量学报.PDFVIP

第３８卷　第２期 计　　　 量　　　学　　　报 　 Ｖｏｌ．３８，№２ ２０１７年　３月 ＡＣＴＡ　ＭＥＴＲＯＬＯＧＩＣＡ　ＳＩＮＩＣＡ 　 Ｍａｒｃｈ，２０１７ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００１１５８．２０１７．０２．２７ 数字ＰＣＲ方法准确测量质粒 ＤＮＡ拷贝浓度 董莲华，　隋志伟，　王　晶，　傅博强 （中国计量科学研究院，北京 １０００２９） 摘要：中国计量科学研究院（ＮＩＭ）利用数字ＰＣＲ技术针对国际比对样品质粒ＤＮＡ，通过设计２对特异性的引 物和探针、优化ＰＣＲ扩增体系、排除ＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘ中的ＤＮＡ污染，成功建立了定量该质粒ＤＮＡ的数字ＰＣＲ方法。 比较了采用单重ＰＣＲ和双重ＰＣＲ方法定量结果之间的差异，最终实现了对比对样品的定量和不确定度评定。对 ３ 线性质粒样品的测量结果及其扩展不确定度（ｋ＝２）为（８０６±０５５）×１０ｃｏｐｉｅｓ／ｍｇ，该结果在比对参考值不确定 度范围内，且与参考值非常接近。 关键词：计量学；质粒ＤＮＡ；数字ＰＣＲ；拷贝浓度；国际比对；可比性 中图分类号：ＴＢ９９　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１０００１１５８（２０１７）０２０２４７０５ ＡｃｃｕｒａｔｅＰｌａｓｍｉｄＤＮＡＣｏｐｙＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ ＤＯＮＧＬｉａｎｈｕａ，　ＳＵＩＺｈｉｗｅｉ，　ＷＡＮＧＪｉｎｇ，　ＦＵＢｏｑｉａｎｇ （ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｅｔｒｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２９，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＮＩＭｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｗｏｄｉｇｉｔａｌｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ｄＰＣＲ）ａｓｓａｙｓｆｏｒｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇｔｈｅｐｌａｓｍｉｄＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｄｅｓｉｇｎｉｎｇｔｗｏｐａｉｒｓｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒａｎｄｐｒｏｂｅ，ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇＰＣＲａｍｐｌｉｆｙｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｅｘｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅ ＤＮＡｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘＴｈｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｂｙｓｉｍｐｌｅｘａｎｄｄｕｐｌｅｘｄＰＣＲａｒｅｃｏｍｐａｒｅｄＴｈｅＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｉｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｑｕａｎｔｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｄＰＣＲｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｈｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙｉｓｅｖｅｎｔｕａｌｌｙｅｖａｌｕａｔｅｄ ３ Ｔｈｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｗｉｔｈｉｔｓｅｘｐａｎｄｅｄｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ（ｋ＝２）ｉｓ（８０６±０５５）×１０ｃｏｐｉｅｓ／ｍｇ，ｉｔａｇｒｅｅｗｅｌｌｗｉｔｈｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｖａｌｕｅｗｉｔｈｉｎｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙａｎｄｖｅｒｙｃｌｏｓｅｔｏｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｖａｌｕｅ Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｅｔｒｏｌｏｇｙ；ｐｌａｓｍｉｄＤＮＡ；ｄＰＣＲ；ｃｏｐｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ；ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ 方法之间的可比性等因素。为此，国际计量局 １　前　言 （ＢＩＰＭ）下设的物质量咨询委员会（ＣＣＱＭ）生物分 核酸含量测量具有广泛的应用，如转基因检测、 析工作组（ＢＡＷＧ）组织了针对核酸绝对定量方法研 食品中微生物污染以及临床中传染病诊断等方面均 究的国际计量比对（