胶原壳聚糖纤维蛋白胶不对称支架的制备及其在组织工程皮肤构建中的应用-外科学(烧伤)专业论文.docxVIP

浙江大学硕士论文胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，它具有生物相容性好、易降解、 浙江大学硕士论文 胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，它具有生物相容性好、易降解、 低抗原性的特性，是组织工程支架中广泛使用的一种生物材料。壳聚糖由在自然 界广泛分布的甲壳素经脱乙酰化处理制得，这两者都属于天然生物可降解材料， 在自然界分布广泛，制取比较容易，所需成本也较低。将这两种成分按一定比例 混合，再通过胶联处理，制备的胶原．壳聚糖多孔材料，微观下成蜂窝状的多孔 结构，结构较为均一，孔径在80-150”m范围之内，研究表明，此种支架适合真 皮成纤维细胞的迁移和生长，可以作为一种诱导真皮再生的良好支架。但是，完 全意义上的组织工程皮肤应当包括表皮和真皮的完整结构，我们要制各具有更大 临床应用价值的组织工程复合皮肤，就不仅需要有真皮结构，还要有多层的表皮 结构。而构成真皮结构的成纤维细胞和形成表皮结构的表皮细胞在支架中具有不 同的分布和生长状态。胶原．壳聚糖均一的多孔结构，似乎不能很好地满足这种 要求。我们需要一种具备更佳微观结构的生物支架，既能适应成纤维细胞的接种 生长，又能适应表皮细胞生长融合的需要。Wang等利用明胶、6一硫酸软骨素、 透明质酸，采用冷冻一冻干的方法制成一种不对称的双面膜，两面具有不同孔径 结构，上面一层较薄，孔径较小(20—501an)，底下一层较厚，孔径较大(平均 1501m1)，体外构建时，在上面小孔层培养角朊细胞，而在底下的大孔中接种真皮 成纤维细胞。此种支架表层的小孔既可防止下层成纤维细胞向上生长，也可防止 表层角质形成细胞落入成纤维细胞层面。研究表明它能很好的适应组织工程复合 皮肤构建需求。 纤维蛋白由纤维蛋自原在凝血酶的催化下聚合而来，具有良好的组织和细胞 相容性，在体内可降解，临床上主要被用作手术过程中的止血剂和组织粘合剂。 研究表明它具有促进细胞黏附、增殖和迁移的作用，目前亦被作为一种良好的载 体材料用于组织工程的创伤修复。此外纤维蛋白在微观下呈多孔网状结构，而且 其结构与纤维蛋白原以及凝血酶的浓度和混合比例有关。于是，在本实验中，我 们尝试将纤维蛋白复合到胶原一壳聚糖多孔支架上，从而制备出一种更能适应组 织工程皮肤构建的不对称细胞支架。 目 的 渐Ⅱ大学硕士论文利用高分子生物材料胶原．壳聚糖和纤维蛋白胶制备适应组织工程皮肤构建 渐Ⅱ大学硕士论文 利用高分子生物材料胶原．壳聚糖和纤维蛋白胶制备适应组织工程皮肤构建 的不对称支架，并探讨其用于体外组织工程皮肤构建的可行性。 材料和方法 一．皮肤细胞的分离培养 1．人真皮成纤维细胞(Fbs)的培养 取包皮环切术后的皮肤块，以组织块培养法分离出人真皮成纤维细胞，并传 代培养，选择3—8代细胞作为工作细胞，用于组织工程皮肤构建。 2．人表皮细胞的培养 选择由本院皮肤科馈赠的人角质形成细胞系(HaCaT)，解冻复苏后加入 DMEM(高糖，含10％胎牛血清，100U／ml青霉素，100U／ml链霉素)培养基， 置于37℃， 5％c02的饱和湿度孵箱中培养，2天换次液，传代培养。 二．胶原。壳聚糖／纤维蛋白胶不对称支架的制备 将由牛跟腱中提取出的胶原和壳聚糖分别溶于0．5mol／L的乙酸溶液中，配 制浓度为0．5％的胶原溶液和壳聚糖溶液，再将胶原溶液和壳聚糖溶液按质量比 9：1混合均匀，注入模具；采用冷冻一冻干法，--20℃冷冻2小时后，置冻干 机中冻干，得到胶原／壳聚糖，再将其置105℃真空干热处理24小时，再置于浓 度比为2：l的l一乙基一3—3(二甲基胺丙基)一碳化二亚胺(EDAC)和N一羟基 丁二酰亚胺(NHS)混合溶液中交联处理24小时，用三蒸水反复漂洗后，再次冷 冻一冻干便获得EDAc—NHS交联的胶原一壳聚糖多孔支架。将此种多孔支架置于 75％乙醇中浸泡消毒过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)反复漂洗5次以上；将配好浓 度的纤维蛋白原溶液以509Fcm2的量均匀涂覆在其表面，再以等量的凝血酶滴 加在其上，室温或37℃温箱静置30分钟，获得胶原．壳聚糖／纤维蛋白胶不对称 支架。 三．胶原一壳聚糖／纤维蛋白胶不对称支架的组织学和微结构观察 将纤维蛋白原(原浓度为80m∥m1)用DMEM培养基配成浓度为40m∥ml 浙江大学硕士论文和8mg／ml，将凝血酶(原浓度为600U／mi)用DMEM培养基配成浓度为300U／ml 浙江大学硕士论文 和8mg／ml，将凝血酶(原浓度为600U／mi)用DMEM培养基配成浓度为300U／ml 和60U／ml：将纤维蛋白原溶液以50p．1／cm2的量均匀涂覆在已消毒的胶原．壳聚 糖多孔支架表面，再以相应浓度等量(体积)的凝血酶滴加在其上，室温或37℃温 箱静置30分钟，待纤维蛋白原聚合成胶后，获得胶原．壳聚糖／纤维蛋白胶不对 称支架。