窖蛋白的调控在肺动脉高压治疗中的作用-内科学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 泰山医学院硕士学位论文 窖蛋白的调控在肺动脉高压治疗中的作用 研究生：汪 磊 专 业：内科学 导 师：薛玉增 教授 王乐信 教授 中文摘要 目的 在本研究中建立肺动脉高压模型，模型建立后采用静脉注射 F92A-Cav1 基因修 饰的 BMSCs 的方法。探索 F92A-Cav1 基因通过 ERK 信号通路促进肺动脉高压新生 血管形成的分子机制，并且探明 F92A-Cav1 基因修饰的 BMSCs 移植对肺动脉高压的 影响。 方法 首先，采用分子生物学方法构建 LV-Cav1 与 LV-F92A-Cav1 慢病毒载体，构建 的慢病毒载体通过 PCR 鉴定、测序鉴定、酶切鉴定，获得插入目的基因序列正确的 慢病毒载体；采用 Western blot 观察 BMSC 细胞中 Cav 蛋白的表达，阳性质粒通过转 化、病毒包装、病毒浓缩及纯化获得高滴度的慢病毒颗粒；其次，采用 10mg/ml 野百 合碱建立肺动脉高压大鼠模型，将 Wistar 大鼠随机分为 5 组：即正常对照组、肺动 脉高压模型组、阴性对照组（LV-ZsGreen 感染 BMSCs 细胞）、Cav1 组（LV-Cav1 病毒感染 BMSCs 细胞）、F92A-Cav1 组（LV-F92A-Cav1 病毒感染 BMSCs 细胞）； 将感染各种质粒的 1×108/ml 的 BMSCs 于 PAH 模型建立 2W 后分别移植给各组大鼠， 2w 时间为一疗程，治疗 2 个疗程，2 个疗程后观察大鼠存活及一般情况；最后，于 移植后 4W 处死大鼠，采用生理记录仪记录各组大鼠肺动脉压力；H.E 染色观察肺小 动脉壁结构变化。免疫组化法测定 MEK 蛋白的表达；western blot 观察肺组织中 VEGF、ERK 蛋白的表达情况；Realtime-PCR 检测肺组织中 Transgelin、ROCK mRNA 的表达。 结果 经 PCR 鉴定、测序鉴定、酶切鉴定证明慢病毒载体构建成功；Western blot 证实 转导 LV-Cav1 与 LV-F92A-Cav1 慢病毒质粒的 BMSCs 细胞 Cav 的表达增高；各组质 1 泰山医学院硕士学位论文 粒转染 293T 细胞的转染效率达 85%以上；与正常对照组相比，经野百合碱注射的 Wistar 大鼠肺动脉压力明显增高，PAH 大鼠模型构建成功；负载不同慢病毒基因的 BMSCs 移植 PAH 大鼠后，与正常对照组相比，PAH 大鼠生活一般状况较差，饮食 量减少，死亡率明显增高，肺动脉压力增高，肺小动脉壁增厚，肺组织中 MEK、 Transgelin 及 ROCK 表达增加（p0.05，p0.01），VEGF、ERK 表达无明显改变 （p0.05）。而与 PAH 组相比，F92A-Cav1 组大鼠，一般状况较好，饮食量增加， 无大鼠死亡，肺动脉压力降低，肺小动脉壁变薄，肺组织中 MEK、ERK 及 VEGF 表 达显著增加（p0.05，p0.01），Transgelin 及 ROCK 表达明显减少（p0.05，p0.01）。 结论 经 PCR 鉴定、测序鉴定、酶切鉴定及 Western blot 证明载体构建成功；大鼠 PAH 模型构建成功；移植 F92A-Cav1 基因修饰的 BMSCs 可以有效改善大鼠的一般状况， 降低肺动脉压力，改善肺小动脉管壁增厚程度、减缓右心室肥厚的程度；F92A-Cav1 基因可以增强 VEGF 的活性，进而激活 MEK/ERK 信号传导通路，活化内皮细胞增殖， 刺激新血管生成；F92A-Cav1 基因还可以抑制 Transgelin、ROCK mRNA 的表达，进 而阻止肺部血管平滑肌的增殖，抑制血管压力的升高。 关键词： 窖蛋白；肺动脉高压；骨髓间充质干细胞；血管内皮生长因子；治疗 2 泰山医学院硕士学位论文 THE EFFECT OF CAVEOLIN IN THE TREATMENT OF PULMONARY ARTERIAL HYPERTENSION Postgraduate: Wang Lei Profession: Cardiovascular Medicine Supervisor: Xue Yuzeng Wang Lexin Objective ABSTRACT Pulmonary artery hypertension is a seriousness progressive pulmonary vascular disease, its pathogenesis is still not fully understood. Except for the proliferation of pulmonary vessels, systolic and d