降脂药物筛选模型的建立及其在决明子降脂作用机理研究中的应用-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

降脂药物筛选模型的建立及其在决明子 降脂药物筛选模型的建立及其在决明子 降脂作用机理研究中的应用 专业： 生物化学与分子生物学 硕士生：唐建华 指导教师：张义正教授 摘 要 低密度腊蛋白受体(10w density lipoprotein receptor，LDLR)是一种表达丰 富的膜糖蛋白，存在于多种组织，尤其是在肝细胞中表达丰富。LDLR与脂代 谢关系密切，血浆中胆固醇主要是由肝细胞表面的LDLR清除。LDLR还与多 种心脑血管疾病例如冠心病、动脉粥样硬化等疾病关系密切，因此建立靶向 LDLR的筛选模型，对寻找或发现治疗高胆固酵血症、冠心病等疾病的新药具 有重要意义。传统中药蕴涵珍贵资源，为了从传统中药中筛选降脂药物，本研 究克隆了LDLR启动子，并将此启动子与荧光素酶报告基因相连接，构建了低 密度脂蛋白受体／荧光素酶(LDLR／Luc)报告基因。将LDLR几uc报告基因质 粒转染至HepG2细胞(称转染细胞)，并优化了各种反应条件，包括细胞接种 密度、细胞培养时间以及检测底物浓度等条件，在最佳的实验条件下，系统显 示了较高荧光素酶活性；实验进一步选择常用降胆固醇药物普伐他汀作为阳性 对照药物，发现普伐他汀不同浓度及不同孵育时间可明显提高LDLR／Lue转录 活性，呈一定的时间和浓度依赖性。以上结果表明成功地建立了靶向LDLR转 录活性的报告基因药物筛选体系。应用该体系对500余种中药提取物进行了筛 选，决明子、穿龙薯蓣等提取物显示阳性，与已报道采用动物模型获得的体内 降脂实验研究结果一致：决明子为成熟豆科植物决明子的干燥成熟的种子，性 寒．味甘苦，祖国医学认为具有清肝明日、利水、通便之功效。药理实验及临 床实验均证实决明子能够降低血浆胆固醇。但对于决明子降脂作用的具体机制 则未见报道。为研究决明子对HepG2细胞低密度脂蛋白受体转录和表达的影 则未见报道。为研究决明子对HepG2细胞低密度脂蛋白受体转录和表达的影 响，进行了以下实验，以下实验均以普伐他汀作用的转染细胞为阳性对照，以 非药物处理细胞作为阴性对照。1，使用LDL刚Luc转染细胞，将决明子醇提取 物(称醇提物)加入转染细胞培养基(称提取物培养基)孵育后，通过荧光检 测，评价该提取物对LDLR／Luc系统荧光素酶活性的影响；2，以三磷酸甘油醛 脱氢酶(GADPH)基因为内标，设计GADPH和LDLR检测性引物，通过半定 量RT-PCR方法检测生长于决明子提取物培养基中转染细胞工D．职的mRNA水 平的变化；3，制备决明子提取物培养基孵育的HepG2细胞总蛋白。通过Western 方法检测LDLR蛋白质表达水平的变化。以普法他汀作用转染细胞为阳性对照， 以非药物处理细胞为阴性对照的实验显示，决明予能增强LDLR报告基因表达， 提高HepG2细胞LDLR的转录和翻译水平，结论是决明子能增强LDLR基因表 达，为决明子降脂的分子作用机理研究奠定了基础。 关键词：低密度脂蛋白受体，荧光素酶，报告基因，决明子，药物筛选，中 药现代化 Construction Construction of Cholesterol—Lowering Drug Screening Model Application in Study of the Cholesterol—Lowering Mechanism of Cassia Seed Major：Molecular Biology Candidate：Jian-Hua TANG Tutor：Prof．Yi··zheng ZHANG Ahstract Low-density lipoprotein receptor(LDLR)is a glycoprotein plentiful in the cell membrane，existing in many kinds of tissues，especially in the liver cells．LDLR is closely related to cholesterol metabolism and cleans the cholesterol in blood．Also LDLR iS closely related t0 many cerebrovascular／cardiovascular disease，such as coronary heart disease and atherosclerosis．Therefore，to construct screening model tageting LDLR will be significant for the search and discovery of new drugs which can cure hype