酵母双杂交系统的抗HIV中草药的快速筛选-生物学·细胞生物学专业论文.docxVIP

摘要目的：HIV是一种反转录病毒，是艾滋病的病原体，根据2010年UNAIDS的全球 摘要 目的：HIV是一种反转录病毒，是艾滋病的病原体，根据2010年UNAIDS的全球 报告，截止到2009年底，约有3330万人感染HIV，而死于艾滋病的人数约180万。尽 管至今已采取大量的科学，社会及政治力量来限制艾滋病的流行，但是世界上几乎没有 地区可以避免。更令人沮丧的是在世界上，某些地区的感染率依然在增加。现今，高效 抗反转录病毒疗法(HAAI盯)运用反转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的组合来抑制病毒 的复制，在很大程度上改善了患者的临床状况，增加了患者的寿命以及生活质量。然而， 除严重的副作用以及价格昂贵外，该疗法还会导致抗药物的病毒突变体的产生。总之， 仍然急切需要新的高效的阻断病毒复制的药物。研究表明HIV Tat通过hcyclinTl与 P-TEFb复合物结合，这个Tat／P．TEFb复合物与TAR相互作用导致RNA聚合酶II C端 结构域的高磷酸化，而高磷酸化的RNA聚合酶II大量延伸HIV的转录本，保证了HIV 的复制。本文以P．TEFb为靶点，运用酵母双杂交技术建立了抗HIV中药的筛选模型。 在酵母双杂交系统中Tat和人类cyclinTl相互作用，因此我们可通过检测药物对Tat和 hcyclinTl相互作用的影响，从而快速完成对药物的筛选。 方法：我们以pCDNA3．hcyclinTl和pEGFP．Tat质粒为模板，PCR扩增出人类 cyclinTl和HIV Tat基因，并将其分别插入真核表达载体pGBKT7和pGADT7．Rec中， 然后运用LiAc转化法将酵母双杂交载体分别转入AHl09和Y1 87菌株中，将筛选二种 的阳性克隆接合后筛选出阳性二倍体，验证出HIV Tat和人类cyclinTl蛋白相互作用， 运用二倍体酵母双杂交系统筛选具有抑制两蛋白相互作用的中药。 结论：成功地构建了酵母双杂交载体，建立了酵母双杂交系统，在对20种单味中 药的筛选中，成功地筛选出四种能够抑N-者相互作用的中草药，为进一步进行配伍和 体外(细胞内)试验证实对HIV的抑制作用奠定了坚实的基础。 关键词：人类免疫缺陷病毒，P．TEFb复合物，反式激活子，人类周期蛋白T1，酵母双 杂交 ABSTRACTAIM：HIV ABSTRACT AIM：HIV which is retrovirus，is the causative agent of AIDS．According to the 20 1 0 UNAIDS Report the Global AIDS Epidemic，there 33．3 million people who lived with HIV at the end of 2009， and approximately 1．8 million died of AIDS．To date，enormous scientific，social and political efforts have been taken to intervene the AIDS epidemic，but there is almost region which has been spared in the world．It is even more devastating that the rates of infection are increasing in some region of the world． Currently，highly active antiretroviral therapy(HAART)also known as combined therapy,applies the combination of inhibitors of the reverse transcriptase and inhibitors against the HIV protease tO the patients， improving the clinical condition and the quality of the patients，and also extending the life span of the patients enormously．However，it use in AIDS patients leads to the formation of mutants that are resistant to the drug，apart from the side effects．In brief,there is urgent need for novel drugs against the replica