结核分枝杆菌甲基化肝素结合血凝素的表达及其在结核病免疫诊断中的应用-免疫学专业论文.docxVIP

温州医科大学硕士学位论文结核分枝杆菌甲基化肝素结合血凝素的表达及其在结核病 温州医科大学硕士学位论文 结核分枝杆菌甲基化肝素结合血凝素的表达及其在结核病 免疫诊断中的应用 摘要 目的： 本研究旨在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis，M．smegmatis)中表达 与纯化甲基化肝素结合血凝素蛋白(methylated heparin．binding haemagglutinin adhesin，mHBHA)，研究mHBHA在鉴别诊断潜伏结核感染(1atent tuberculosis infection，LTBI)和活动性结核病(active tuberculosis，ATB)中的价值，以及评 估mHBHA在结核病血清学诊断中的价值。 方法： 1、利用PCR方法从Mycobacterial tuberculosis(M．tb)H37Rv基因组中扩增HBHA 编码基因，克隆到分枝杆菌穿梭表达质粒pMFA41中，构建pMFAH41原核表 达质粒，然后将重组质粒电转化M．smegmatis表达，并通过Ni2+亲和层析柱加 以纯化，对其特异性及其甲基化修饰进行鉴定。 2、将纯化好的mHBHA蛋白通过体夕IIFN．Y酶联免疫斑点技术(enzyme．1inked immunospot assay，ELISPOT)对86例ATB(其中菌阳结核36例，菌阴结核50 例)、15例LTBI、37例健康体检者(healthy control，HC)的外周血单个核细 胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)进行检测， 以 ESAT．6／CFP．10／Rv3615c多肽库作为对照抗原。 3、收集49例肺结核(pulmonary tuberculosis，PTB)、21例肺外结核(extra pulmonary tuberculosis，EPTB)、16例LTBI、25例HC的血清，用mHBHA包被 酶联免疫吸附实验(enzyme．1inked immunosorbent assay，ELISA)板，检测 血清中mHBHA抗原特异性IgG、lgA抗体水平，P以ESAT．6、A985A作为对照 抗原。 结果： l、成功构建JpMFAH41重组质粒，表达并纯化了mHBHA，其特异性与甲基化 修饰鉴定正确。 2、基于mHBHA为基础的ELISPOT检测结果发现LTBl人群PBMCs分泌IFN-丫的 T细胞频数显著高于ATB患者，差异有统计学意义(P0．05)，且与病原检 出或结核感染方式无关，结果显示无论是茵阳结核与菌阴结核，亦或是PTB 与EPTB，都与LTBl人群存在统计学差异，而以ESAT．6／CFP．10／Rv3615c为对 照抗原刺激时则没有统计学差异(扮0．05)。mHBHA检测LTBI的受试者工 万方数据 温州医科大学硕士学位论文曲线(receiver．operating 温州医科大学硕士学位论文 曲线(receiver．operating characteristic，ROC)的曲线下面积(area under AUC)为O．809(P0．0002)，准确性较好，而对照抗原检测LTBI的AUC仅 为0．607(PO．05)。 3、抗mHBHA、ESAT．6、A985A抗原特异性IgG水平PTB组显著高于HC组； mHBHA抗原特异性的IgA水平PTB组显著高于HC组(P0．05)，ESAT．6、 A985A抗原特异性的IgA水平在两组间却无差异(胗0．05)。ROC曲线分析 mHBHA检测PTB的AUC为0．703沪0．05)，ESAT．6检测PTB的AUC为0．574 (P0．05)，A985A检测PTB的AUC为0．560伊0．05)。 结论： 应用mHBHA作为抗原建立的IFN吖ELISPOT方法在鉴别诊断潜伏结核感染 和活动性结核方面具有潜在的应用价值，尤其对于菌阴结核的快速诊断具有一 定的临床意义；而且mHBHA蛋白用于检测肺结核的诊断效能较好，可作为结核 病血清学诊断的备选抗原之一。 关键词：结核分枝杆菌，肝素结合血凝素，IFN吖，免疫学诊断 万方数据 温州医科大学硕士学位论文Expression 温州医科大学硕士学位论文 Expression and Application in Tuberculosis Diagnosis of Methylated Heparin．binding Haemagglutinin Adhesin from Mycobacterium tuberculosis Abstract Objective：This study aims to express methylated heparin-binding haemagglutinin