结核杆菌异烟肼耐药相关基因inhA作用机制的研究-内科学专业论文.docxVIP

结核杆菌异烟肼耐药相关基因l 结核杆菌异烟肼耐药相关基因l nhA作用机制的研究 中文摘要 异烟肼是抗结核治疗中最重要的一线药物之一，也是目前耐药现 象上升最快和最为严重的药物。结核杆菌对异烟肼产生耐药性的机制 较为复杂，与多个基因有关，其中KatG基囤I和inhA基因的突变是最 为重要的原因。为明确irthA基因在INH耐药中的意义，本丈对其进行 了一系列研究。 r一1’、一 第一部分：结核杆菌临床分离株inhA基因的序列分析 阳的：了解本地区异烟肼临床耐药株inhA基因的突变情况。方法：以 l,cR法对36株异烟肼耐药株和9株敏感株的inhA全基因进行扩增，对 PCR产物以DNA自动测序仪直接测序。结果：敏感株未出现inhA的变 异；有25株耐药株出现了inhA基因的突变(69．4％)，其中约有1 2 株产生了错义突变(33．3％)；变异多属点突变，多集中在14、47、 65、78、1 94、2 32等氨基酸位点附近。结论：本地区耐异烟肼结核菌 株inhA的突变率为33．3％左右，突变位点分布较广，但大多集中在 NADH结合区附近。1 第二部分：结核杆菌inhA基因的克隆、表达及高纯度的inhA蛋白的 制备 {目的：对结核杆菌H37Rv的inhA基因进行克隆、表达并纯化表达产 物。方法：构建含目的基因的表达质粒pET一24b／inhA，经酶切鉴定和 测序检验后转化大肠杆菌BL21(DE3)，然后以异丙基硫代一B—D一半乳 糖苷(IPTG)对其诱导4小时，获得稳定的高表达菌后，以Nit—NTA SuperflOW亲和层析柱对表达产物进行纯化。结果：酶切鉴定和DNA 测序显示了所构建的重组质粒已成功的克隆了inhA基因；转化pET一 24b／inhA的大肠杆菌可大量表达--分亍--量约为28．5KD的蛋白，产量最 高可达细菌蛋白总量的30％左右；经Nit—NTA SuperflOW亲和柱纯化 N．-j-得到高纯度的蛋白。结re：inhA基因克隆、表达获得成功，并得 到了高纯度的inhA蛋白。}7 第三部分：inhA与异烟肼作用相关的基因功能的研究 目的：了解inhA与烟酰胺腺嘌呤二杀夔萱酸(NADH)的作用，建立量化 目的：了解inhA与烟酰胺腺嘌呤二杀夔萱酸(NADH)的作用，建立量化 两者的作用强度方法。防法：将0．8mg／ml的inhA蛋白与lmM的NADH 室温作用10min，200一400nm范围连续扫描作用前后inhh蛋白，比较 其吸收光谱的变化；将0．35mg／ml的inhA分别与4uM、lO uM、20 uM、50 uM、1 00 uM的NADH室温作用i 0min，同样检测其吸收峰的变 化，通过米基壅程的推导求出inhh与NADH复合物的解离常数。结 果：与NADH作用后inhh吸光峰的幅度显著减小，出现了新吸光峰： 经米氏方程的推导求得的解离常数为14．6xlO-6mol。彳结论：成功建立了 检测inhA可与NADH结合强度的方法。 关键词： 结核病? 异烟肼j 耐药机制 Studies Studies on mechanism of inhA gene in Mycobacterium tuberculosis resistance to isoniazid Abstract Isoniazid(INH)iS one of the most important antituberculosis drugs． However,the resistant rate to INH is increasing very fast in recent years． The mechanism of M．Tuberculosis resistant to INH is complicated． which is associated with several genes．Among them．the mutation of KatG and inhA is the most important cause of INH resistance．To characterize the role of inhA gene in the mechanism of INH resistant．we do following studies． Part I Sequencing study for inhA gene of INH resistant clinic isolates of mycobaeterium tuberculosis Purpose To characterize the inhA genetic variations in INH．resistant clinic isolates．M