结核杆菌抗原Ag85B诱发抗肿瘤免疫应答及其机制研究-免疫学专业论文.docxVIP

山东省医学科学院研究生毕业论文扉页 山东省医学科学院研究生毕业论文 扉页 研究生指导教师：田志BJ0魏海明 课题指导小组 |千|志刚，男，1956年10月11日出生，山东莱州人。博士，研究员，博士生导 师。主要研究领域：天然杀伤(NK)细胞的基础生物学特性、肿瘤生物治疗、细胞 因子基因工程药物及其用于治疗重大疾病(癌症、传染病、自身免疫病、器官与 骨髓移植)的应用、肿瘤免疫逃逸、肝脏免疫学等研究。 魏海明，男，1963年10月8日出生，安徽肥东人。免疫学专业博士，副研究员， 硕士生导师。主要从事NK细胞免疫生物学、肿瘤生物治疗、肝脏免疫学等研究。 孙油，女，1959年6月6日生，研究员，硕士生导师。主要从事内分泌和细胞 免疫研究。 张建，女，1965年4月生，研究员，硕士生导师。主要从事细胞因子、基因工 程药物、肿瘤生物治疗研究。 山东省医学科学院研究生毕业论文学位论文独创性声明 山东省医学科学院研究生毕业论文 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中引用 他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的 任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东省医学科学 院。山东省医学科学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权 利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单 位仍然为山东省医学科学院。 论文作者签名：羔堂塞 导师签名 日期：2型年—￡月An 山东省医学科学院研究生毕业论文 山东省医学科学院研究生毕业论文 结核杆菌抗原A985B诱发抗肿瘤免疫应答及其机制研究 专 业：免疫学 研究生：吴学忠 指导教师：田志刚 魏海明 中文摘要 A985B又称MPB59或c1一Ag，分子量为30KD，是结核杆菌和卡介苗(BCG)主要 分泌蛋白A985复合物(A985，包括A985A、A985B和A985C，相对分子量介于30—32KD) 中的组分之一。据文献报道，大量的动物试验证明A985B能被T细胞表位识别，并 能诱导产生特异性免疫保护，尤其是能诱导特异性CTL的形成。另据文献报道，A985B 在分枝杆菌分泌蛋白中含量占居首位，在一系列纯化抗原试验中，该抗原的抗原性 最强。为探讨A985B诱发抗肿瘤免疫应答及其机制，我们进行了BCG A985B基因的克 隆、真核载体构建、转染肿瘤细胞(B16细胞)，及其转染肿瘤细胞促增殖活性的检 测，然后进行其诱发抗肿瘤免疫应答及其机制研究的探索。 目的：通过对BCG A985B基因克隆、真核载体构建、转染B16细胞和其促增殖活性 的研究，进一步探讨A985B在诱发抗肿瘤免疫应答中的作用，及其用于肿瘤免疫治疗 的可行性研究。 方法：(1)A985B真核载体的构建。从BCG中提取DNA，用PCR技术扩增编码A985B 成熟蛋白基因，并将扩增的A985B基因片段插入克隆载体pMDl8一T Vector，用PCR、 酶切鉴定筛选阳性克隆和DNA序列分析检测目的基因序列的正确性；从克隆载体 pMDl8一T Vector中切下A985B基因插入真核pcDNA3载体，构建重组pcDNAa—AgS5B载 体，并用PCR和酶切鉴定、筛选阳性克隆。(2)A985B真核载体转染B16细胞。用 脂质体转染技术将pcDNA3-A985B质粒转染B16细胞，用RT—PCR和筛选标记(G418)， 筛选、鉴定出阳性细胞克隆，用Western blotting鉴定其在阳性细胞克隆内的表达。 (3)用PPD+和PPD-人的外周血单个核细胞(PBMC)和。H-TdR掺入法来检测A985B 的促增殖活性。(4)预先建立C57BL／6小鼠背部皮下荷瘤模型，然后用B16 (pcDNA：广A985B)细胞接种于C57BL／6荷瘤模型小鼠背部皮下作为试验组。用B16 细胞和B16(pcDNA3)细胞接种于C57BL／6荷瘤模型小鼠背部皮下作为对照组，观 察试验组和对照组荷瘤小鼠的肿瘤生长、生存时间和不同时间点小鼠血清中的IL一4 及IFN—Y变化情况。(5)预先建立C57BL／6小鼠肺部转移瘤模型，然后用经照射的 B16(pcDNA3一A985B)细胞注射于C57BL／6肺部转移瘤模型小鼠尾静脉作为试验组， 山东省医学科学院研究生毕业论文用经照射的B16(pcDNA：，)细胞注射于C57BL／6肺部转移瘤模型小鼠尾静脉作为对 山东省医学科学院研究生毕业论文 用经照射的B16(pcDNA：，)细胞注射于C57BL／6肺部转移瘤模型小鼠尾静脉作为对 照组，观察试验组和对照组肺部转移瘤小鼠的肺部肿瘤结节生长情况和生存时