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基因敲除技术的原理、方法和应用 2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验 浏览次数：6302 网友评论 0 条 1．基因敲除概述 2 ．实现基因敲除的多种原理和方法： 2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2 利用随机插入突变进行基因敲 除。 2.3.RNAi 引起的基因敲除。 3 ．基因敲除技术的应用及前景 4 ．基因敲除技术的缺陷 关键词：基因敲除 1．基因敲除概述： 基因敲除是自80 年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定 的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用 DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应 用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2 ．实现基因敲除的多种原理和方法： 2 ．1． 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80 年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80 年代初，胚胎 干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985 年， 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987 年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1] 。直到 现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1 利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a ． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基 因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而 兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因 为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验 动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式( 电穿孔法或显微注射)导入同源的胚 胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重 组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地， 显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使 用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的 重组概率为10－2～10-5 ，植物的概率为10－4～10－5 。因此如何从众多细胞中筛 出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法 （PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS 法。[6] ｅ．表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化 前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。[2，3,7] f ．得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如 果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。[8] （见图2 ） 图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 图2. 由嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠 2.1.2 条件性基因敲除法 条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞 或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法[2]。它实际上是在常规的基 因敲除的基础上，利用重组酶Cre 介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因 修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围 和时间处于一种可控状态。 条件性敲除的原理（图2，3 ）： 利用Cre ／LoxP 和来自酵母的FLP—frt 系统可以研究特定组织器官或特定细 胞中靶基因灭活所导致的表型[7]。通过常规基因打靶在基因组的靶位点上装上 两个同向排列的1oxP，并以此两侧装接上loxP 的(“loxP