实验二 、培养基与胰酶的配制.pptVIP

实验二 、培养基及胰酶的配制 一、实验原理： （一）细胞培养的气体环境与pH环境 ( 二）细胞培养的营养条件 1. 培养用液 培养液（基）、缓冲液、平衡盐溶液、血清及消化液、pH调节液和抗生素等。 血清的主要成分及含量 培养基的主要种类（基础培养基） (1) MEM (低限量基础培养基，minimum eessential media): (2) DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium) (3) IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s medium) (4) RPMI1640 (5) HamF10、 HamF12 (6) McCoy’s 5A 消 化 液 0.1-0.25% 胰酶 0.02% EDTA pH=8.0 二、实验目的 1. 掌握DMEM培养基、胰酶的配制 2. 学习针头滤器的使用方法 三、实验步骤 (一） DMEM培养基的配制 1. 三袋DMEM粉末用双蒸水溶解（先加入2/3DDW，再用DDW冲洗袋子）、磁力搅拌器搅拌半小时以上。 2. 加入1.2g/袋 NaHCO3定容3000 mL、搅拌30分钟。 每人在超净台内用大滤器过滤、分装、写好种类、名字。（留取少许做污染测试放CO2培养箱72小时） 3. 每8个人为一组，每人过滤90 mL，其余的过滤到100 mL试剂瓶中，每瓶90mL培养基备用。 使用前在超净台内加入56℃灭活好的FCS 10 mL，使血清的终浓度为10%，4℃保存待用。 （二）胰酶的配制 1. 取实验一中准备好的D–Hanks 液 200 mL （8人一组） 2. 称取0. 5g胰酶（0.25%）放入研磨器中并加入少量D –Hanks液成为糊状，研磨200次，再加入D –Hanks液终体积为200ml，合并胰酶，加0.02%EDTA助消化，磁力搅拌使之完全溶解。（8人一组，分别研磨，再合并） 3. 用NaHCO3 调pH至8.0。 4. 小滤器（实验一中已湿热灭菌过的）过滤除菌至小瓶内,(不能装的过满,防止冷冻后瓶爆裂)、检查滤器、贴好标签、-20℃保存。每人过滤20 mL 。 （注意：1.拧紧滤器2.注射器吸液体3.注射器插好滤器4.对着烧杯慢推压针芯看是否漏5.如不漏对小瓶过滤。6.滤器放在小瓶瓶口上，取下针头再吸液体，反复多次，滤完。7.检查滤器滤膜是否完好。） 四、思考题 1.细胞培养中为什么添加血清？ 2.使用血清需注意哪些方面？ 3.消化液胰酶的浓度是多少？ 4.使用小滤器过滤要注意哪些？