课件：基因工程制药复习.ppt

5’-TTGACA-3’ 5’-TATAAT-3’ ① -35 box ② -10 box（Pribnow Box） （五）影响外源基因表达效率的因素 1. 启动子的结构对表达效率的影响 RNA聚合酶 σ亚基的识别位点 （1）一致顺序 （2）-35区与-10区之间的距离 间隔为16-19 bp时，启动子最强。 （3） -35区和-10区的碱基顺序 越接近一致顺序，启动子越强。 5’-TTGACA TATAAT 一致顺序 lac trp ?PL recA tac I tac II 5’-TTTACA TATGTT 5’-TTGACA TTAACT 5’-TTGACA GATACT 5’-TTGATA TATAAT 5’-TTGACA TATAAT 5’-TTGACA TTTAAT -35 box -10 box 5’-AGGAGGU-3’ S-D序列后面的4个碱基： 如果是A（T），翻译效率最高； 如果是G（C），效率只有50%或25%。 2. 转译起始序列对表达效率的影响 （1）S-D序列 ？？？？ AUG左侧的三个碱基也有影响。 （2）起始密码AUG ?-半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为效； 如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。 多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。 噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白mRNA的核糖体结合位点有多个U。 （3） 其它 3. 启动子与外源基因之间的距离 转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。 增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目, 增加表达效率。 4. 转录终止区对表达效率的影响 5. 载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响 6. 外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响 但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素？ 答： 有以下几方面的因素： ⑴外源基因的拷贝数 ⑵ 外源基因的表达效率①启动子的强弱；②核糖体接合位点的有效性；③SD序列和起始密码ATG的间距；④密码子组成。 ⑶表达产物的稳定性 ⑷细胞代谢负荷 ⑸工程菌的培养条件 酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。 真核或病毒启动子 MCS PolyA信号 终止子 外源基因 二、在真核细胞中的表达 （1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不需要宿主的安全性检验。 酵母表达系统的特点 ①表达量普遍低。 ②常常发生质粒丢失。 ③重组蛋白常常超糖基化 （2）缺点 每个N-寡糖链上含有100多个甘露糖； ④分泌困难。 正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。 分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙。 第五章 基因工程制药的下游技术 重组工程菌的培养（发酵） 基因工程药物的分离纯化 基因工程药物的质量控制 基因工程药物的制造实例 内 容 提 纲 获得目的基因 组建重组质粒 构建基因工程菌（或细胞） 培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装 制备基因工程药物的一般程序 上游阶段 下游阶段 菌种筛选 摇瓶试验 发酵罐中试 由实验室研究到产业化的过程 发酵生产 一、基因工程菌的培养方式 分批培养(batch culture） 补料分批培养(fed batch culture） 连续培养(continuous culture） 透析培养(dialysis culture） 固定化培养(immobilized culture） 第一节、重组工程菌的培养 分批培养 定义：将种子液和培养基一次性装入反应器内，经过一定时间培养后一次性出料的培养过程。 补料分批培养：将种子接入发酵罐中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。 连续培养 定义：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。可考虑两阶段连续培养。 透析培养 定义：利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。 膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成，循环流速，开始透析的时间和透析培养的持续时间段都对产物的产率有影响。 固定化培养 固定化培养技术：是指通过采用物理或化学的方法（物理吸附、化学包埋）将游离微