大鼠足细胞的原代培养及鉴定-第三军医大学学报.DOC

大鼠足细胞的原代培养及鉴定 贾苗，张益民，赖德源 （中山大学孙逸仙纪念医院肾内科，广州 510120） [摘要] 目的 建立一种重复性好、操作简便的大鼠足细胞培养方法。方法 取重量200~220 g的健康雌性SD大鼠，无菌取肾后通过差异过筛法分别通过80、150、200目细胞筛网，收集200目筛网上肾小球进行接种，利用植块法将接种培养面向上放置，4.5 h后将培养瓶翻转过来正常放置于37℃、5%C02的恒温恒湿培养箱进行孵育。采用形态学观察和细胞间接免疫荧光技术，对足细胞进行鉴定，并用流式细胞仪进行足细胞纯度分析。结果 5 d后可见绝大部分肾小球贴壁并有少许肾小球周围有细胞爬出，7~8 d可见所有肾小球周围有大量细胞爬出，胰酶消化后传代培养。形态学及特异性抗体WT-1, nephrin鉴定为足细胞。流式细胞仪分析细胞纯度99%左右。结论 3 [关键词] 足细胞；细胞原代培养；大鼠 [中图法分类号] R322.61； R329.24 [文献标识码] 近年来随着对肾小球疾病发病机制的深入研究发现足细胞损伤是导致其持续进展的关键细胞[1]，如微小病变肾病、局灶节段硬化肾病、膜性肾病和糖尿病肾病等。足细胞因为高度分化、结构复杂、定位特殊，体外培养的方法一直以来都受到国内外学者大量的关注并不断的被改善。国外已有实验室成功建立了人[2]、鼠【3】的条件永久性足细胞株，但由于所要求的技术较高，花费较多，增加了普遍应用的难度，因此本文旨在建立一种简便可行、重复性好的大鼠肾小球足细胞的原代培养方法，为研究肾小球疾病的发病机制等提供一个实验平台。 1 材料与方法 1.1 实验动物 清洁级SD大鼠，雌性，体重200~220 g。购买自中山大学实验动物中心，质量合格证号：0051349，使用许可证：SCXK（粤）2004-0011 。 1.2 主要仪器与试剂 高级荧光分析倒置显微镜，流式细胞仪， 80、150、200目不锈钢细胞筛网购自上海生工。DMEM/F12培养液、ITS、青-链霉素、FBS及0.25%胰酶-0.02%EDTA均购自GIBCO（美国）公司，兔抗大鼠nephrin, WT-1多克隆抗体（Abcam, 美国)，PI（碘化吡啶）和 FITC标记抗兔IgG购自博士德公司。 1.3 大鼠肾小球足细胞原代培养 1.3.1主要试剂的配制 含有5%FBS的完全培养基500mL, 内含有DMEM/F12培养液465mL，FBS25mL，ITS 1.3.2大鼠肾小球的分离 采用差异过筛法【4-6】分离肾小球，并进行适当改进：①脱颈处死大鼠后，固定、消毒，沿腹部前正中线与脐水平线做十字切口，充分暴露肾脏后，用剪刀剪下双侧肾脏，并迅速放置于装有预冷 DMEM/F12培养液的无菌离心管中，迅速移入超净台中，剥除完整肾包膜，用预冷的含有10%青-链霉素的PBS冲洗3次。②沿纵形长轴剖为两半，分离肾皮质在80目筛网剪碎成1~2 [基金项目] 广东省科技计划项目（2007B011000009） [通信作者] 赖德源，电话：（020磨至糜状，边研磨边用冷PBS冲洗，至糜状物颜色发白似纤维结缔组织，收集滤液分别通过150、200目筛网，收集200目筛网上的肾小球。上述操作均在冰盒上进行。 1.3.3 肾小球的接种和培养 将收集的肾小球离心5min, 1 500 rpm, 加入完全培养基2 ml(2只大鼠)重悬，接种至3瓶75 cm2培养瓶内，并每瓶加入10 ml完全培养基，倒置培养瓶使接种面向上放入37 1.3.4 足细胞消化、传代： 肾小球接种第5天首次换液，7-8d后进行消化，将消化下来的产物通过200目筛网以去除肾小球，收集过滤液离心5 min,1 500 rpm, 完全培养基重悬，用血细胞计数板计数，按25 cm2培养瓶：2.0×105 /瓶，24孔板: 3.0×10 1.4 大鼠肾小球足细胞的鉴定 传代培养7 d待细胞分化铺满瓶底后行免疫荧光染色。冷丙酮固定、TritonX-100破膜、BSA封闭后分别加nephrin,WT-1（1:1000)4 ℃过夜，阴性对照组仅加抗体稀释液。加入二抗（1:30)37 ℃避光反应30 min。PI复染核于荧光镜下观察，取图。上述每步操作后都用PBS洗涤。 1.5 流式细胞仪分析细胞纯度 传代7d的成熟足细胞消化后，取1.0×105个细胞，经固定、加入一抗、二抗后，上机检测nephrin阳性细胞比率。 2 结果 2.1 肾小球的分离及培养 ①肾小球的分离：纯度达99%，一只大鼠可得到1.0×105个，视野中基本无肾小管。②肾小球的培养：经植块法，第3天时可见有少许扁平样细胞从贴壁的肾小球中爬出，有形成血管的趋势，为毛细血管内皮细胞（图1A），第5天时可见绝