乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建.doc

PAGE PAGE 1 乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建 【摘要】目的：构建HBVX基因与pCI瞡eo相融合的高效真核表达载体。方法：设计并合成HBVX基因的引物，以HBVDNA阳性血清PCR扩增得到HBVX基因全序列，将X基因连接到真核表达载体pCI瞡eo上后，酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等，鉴定所构建的真核表达载体。结果：以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBVX基因大小相同，酶切也得到目的基因片段，测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论：成功构建了HBVX基因的真核表达载体，为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。 【关键词】乙型肝炎病毒；X基因；真核表达载体 乙型肝炎病毒（HBV）感染在世界范围内广泛流行。全球的HBV感染率约为4%～5％[1]，我国是HBV感染的高发国家之一。HBV不仅是引起肝炎、肝硬化和肝癌的重要原因，而且还可导致肾脏、皮肤和关节等其他组织和器官的病变[2]。HBV含有四个部分重叠的开放读码框架，前S/S区、前C/C区、P区和X区，X基因开放读码框高度保守[3]。HBVX基因由462个核苷酸组成，编码HBVX蛋白（HBx）。HBx是一个小分子蛋白，由154个氨基酸组成[4]。研究表明，HBx在肝细胞的增殖以及肝癌的发病中起到了重要的作用[57]。HBx以直接或间接的方式与宿主或病毒作用，发挥重要的生物学作用[8，9]。pCI瞡eo真核表达载体在多种真核细胞中具有高效的表达能力[10,11]。为了进一步探讨HBx在细胞内的作用及作用机理，特构建pCI瞡eo瞂真核细胞表达质粒。 1材料与方法 1.1PCR扩增X基因用常规PCR方法扩增X基因，以HBV基因组DNA为模板，引物如下，上游引物5’睠CGCTCGAGGTATACATCATTTCCATGGC3’；下游引物5’睠CGGAATTCGAGATGATTAGGCAGAGGTG3’分别在上游引物和下游引物5’端添加限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切位点。PCR循环条件：95℃3min，94℃60s，55℃45s，70℃60s，35个循环。最后72℃10min，4℃10h。 图1PCR产物琼脂糖凝胶电泳PCR产物用低熔点琼脂糖凝胶电泳，结果在500bp处有特异性条带。如图1。 1.2真核表达载体的构建方法OMEGA胶回收试剂盒回收：凝胶回收PCR产物，步骤按说明书进行（德国Qiagen公司）。线性化空载体PCI瞡eo：XhoⅠ（日本Takara公司）4μl，10×Buffer4μl，PCI瞡eo4μl，DW28μl，37℃2.5h。凝胶回收XhoⅠ单酶切后的线性化PCI瞡eo：用OMEGA回收，方法同上，得20μlDNA溶液。再用EcoRⅠ酶切：EcoRⅠ（日本Takara公司）4μl，10×Buffer4μl，PCI瞡eo(经第一次酶切后产物)20μl，DW12μl。37℃2.5h。载体与目的基因的连接：反应体系如下：HBVX13μl，pCI瞡eo4μl，10×Buffer2μl，T4Ligase（美国Promega公司）1μl。反应体系过夜后4℃保存。连接产物的转化：TSB法制备感受态细菌。注意整个过程均在冰上进行，所用物品均需灭菌。重组子鉴定：使用TIANGEN公司质粒小提试剂盒提取PCI瞡eo瞂质粒，酶切鉴定：反应体系如下：EcoRⅠ1.5μl；XhoⅠ1.5μl；质粒DNA4μl；10×H3μl；ddDW20μl。37℃水浴3h，电泳。并随机挑取一个克隆测序。 结果 图2pCI瞡eo睭Bx酶切图2.1pCI瞡eo睭BX酶切图pCI瞡eoHBX经EcoRⅠ和XhoI双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳，可见5.5kb的pCI瞡eo质粒片段和约500bp的目的基因片段，如图2。 2.2X基因序列测定CI瞡eoHBX转化感受态细胞DH5α后选取氨苄抗性克隆，经EcoRⅠ和XhoI双酶切后证实含有目的基因片段后送上海英骏生物技术有限公司进行DNA测序，与GeneBank中X基因adw亚型序列一致。 3讨论 X基因是乙型肝炎病毒DNA中最小的一个开放读码框架，位于1374～1838核苷酸之间，它所编码的X蛋白由154个氨基酸残基组成，分子量16.5kD，它不仅存在于细胞质中，在细胞核中也可以检测到[12]。HBx不仅可以激活HBV增强子、核心启动子、S基因启动子，还可激活猴病毒（SV40）早期启动子、人类免疫缺陷病毒长末端重复序列（HIVLTR）[4]、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSVtk）启动子、以及许多细胞启动子，如α瞘olbin、MHCclass并瘛c瞞yc、c瞛un和EGF受体启动子等[1316]。实验证实，X蛋白是一种反式作用因子，其本身不能与双链DNA直接结合，而是通过蛋白与蛋白之间的相互作用来行使功能，可