荧光定量PCR检测血清和外周血单核细胞中HBV DNA含.doc

PAGE PAGE 1 荧光定量PCR检测血清和外周血单核细胞中HBVDNA含 杨晓静邹雄王立水 　　通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测慢性乙型肝炎及肝癌患者血清和外周 血单核细胞（PBMC）中乙型肝炎病毒（HBV）DNA含量，分析两者的相关性，阐述H BV感染PBMC在乙型肝炎慢性化和向肝癌恶性转化中的作用。 1.资料与方法： (1)研究对象：慢性乙型肝炎患者36例，年龄17～55岁，平均31.2岁；乙型肝 炎后肝癌患者15例，年龄34～68岁，平均47.6岁。诊断依据文献。选择本院职工和 健康查体者20例作为正常对照，年龄21～50岁，平均31.5岁。(2)方法:用淋巴细 胞分离液分离PBMC，pH7.2PBS10ml洗涤5次，以去除残留的血浆HBVDNA，收集末 次洗液（500μl）及细胞，调整细胞浓度至2×109/L，取100μl细胞悬液加等量细 胞裂解液反应20min，显微镜观察证实细胞完全裂解。100μl血清、洗液或PBMC裂 解液常规碱裂解法提取HBVDNA，在Bio-RadiCycler自动荧光PCR检测仪上测定， 由计算机软件分析计算定量结果。试验的灵敏度为103拷贝/ml，病例均以lt;103拷 贝/ml为阴性结果。为便于统计，以检测结果绝对值的对数值进行比较。(3)统计处 理：使用SPSS10.0统计软件行t检验和χ2检验。 2.结果： 慢性乙型肝炎和肝癌患者血清HBVDNA阳性率分别为44.44%（16/36）和60.00 %（9/15），阳性标本HBVDNA含量对数值分别为5.25±1.25和5.71±1.31，两者比 较差异无显著性。肝癌患者PBMCHBVDNA阳性率为80.00%（12/15）高于慢性乙型 肝炎患者47.22%（17/36）（χ2＝4.64，P＜0.05），两者间HBVDNA含量对数值（ 4.62±1.13与4.05±0.91）差异无显著性（t＝1.90，P＞0.05）。慢性乙型肝炎和 肝癌患者血清HBVDNA总阳性率为49.02%(25/51)，和PBMC内HBVDNA总阳性率56.8 6%(29/51)相近。血清和PBMCHBVDNA均为阳性的患者占全部病例的47.06%（24/5 1），均为阴性的患者占41.18%（21/51），血清和PBMC检测结果一致的患者占88. 24%（45/51），两者差异有相关性（χ2＝30.62，P＜0.01）。慢性乙型肝炎患者 中PBMC内HBVDNA（+）而血清HBVDNA（－）的占5.56%（2/36），肝癌患者中PBM C内HBVDNA（+）而血清HBVDNA（－）的占20.00%（3/15），两者差异无显著性( χ2＝1.13，P＞0.05)。血清和PBMCHBVDNA均为阳性的15例慢性乙型肝炎和9例肝 癌患者血清和PBMCHBVDNA含量对数值间均呈正相关，相关系数分别是0.9477和0 .9506，t值分别为10.71、8.10，P值均＜0.01。正常对照组血清和PBMC标本HBVD NA均为阴性，提取PBMC的末次洗液HBVDNA均为阴性。 3.讨论 　　荧光定量PCR（FQ-PCR）技术融汇PCR和荧光探针杂交技术的优点，直接探测P CR过程中荧光信号的变化，根据PCR反应的酶动力学特点，获得DNA模板的准确定量 结果。血清HBVDNA检测对HBV暂不释放入血的肝内外感染不易检出，有一定的局限 性。而肝组织HBVDNA的检测必须借助于肝穿刺获得标本，限制了其常规应用。所 以对许多暂不具备开展肝穿刺条件者，通过PBMCHBVDNA的检测能间接反映肝细胞 内HBVDNA的存在情况，从而对慢性乙型肝炎患者HBV的复制状态有更准确的评价。 慢性乙型肝炎和肝癌患者中HBV感染PBMC的情况较为常见，肝癌患者PBMCHBVDNA 阳性率显著高于慢性乙型肝炎患者，PBMC和血清HBVDNA阳性率间有相关性，血清 和PBMCHBVDNA含量对数值间呈高度正相关，说明在慢性乙型肝炎和肝癌患者中， PBMC和血清中HBVDNA的变化呈一致性趋势。慢性乙型肝炎和肝癌中尚存在血清HB VDNA阴性而PBMCHBVDNA阳性的患者，两组间的差异虽无统计学意义，但肝癌组 有增高趋势。PBMCHBVDNA阳性的患者其血清HBVDNA阴性，可能是这类患者体内 病毒复制正处于低谷期，血清中HBV量很低，病毒多隐匿于细胞中。一方面，隐匿 于PBMC中的HBV作为潜在的传染源，引起病毒重复感染和肝脏病变反复活动；另一 方面，HBV长期存在于PBMC和肝细胞中，增加了HBV的整合机会，这可能是肝癌发生 发展的高危因素。PBMCHBVDNA的检测是对血清HBVDNA检测的重要补充，HBV感染 PBMC可能在乙型肝炎的慢性持续及向肝癌的恶性转化中起重