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PAGE PAGE 1 用于TB-DNA扩增的痰标本前处理 据国内外大量文献资料显示，肺结核发病率正呈现增长趋势，并且由于抗生素的大量使用和不规则治疗，结核杆菌（TB）产生耐药株而致难治性结核，给临床确诊、治疗肺结核带来了困难。检出痰中含有TB是临床诊断肺结核或鉴别肺结核与其他肺病的重要依据，痰中TB的检测方法常规采用痰涂片及痰培养。涂片虽简单易行，但阳性率低，培养虽为金标准，但周期太长，均难以满足临床需要。近年来，作为直接检测分支杆菌、种系鉴定和药敏试验的许多分子学方法得到了长足发展，这些方法能够将诊断时间从几周大大缩短到几天。其中，实时动态荧光定量PCR（FQ-PCR）因其技术成熟具有较高的灵敏度和特异性，已逐渐应用与临床。在FQ-PCR检测痰TB的应用中，痰标本的留取和前处理将直接影响检测的灵敏度结果的准确性，常规使用的碱消化法不仅影响菌体活性难以用于培养，而且因其消化能力差，用量大，造成了对样本的稀释，故不利于提高检出率。本文采用胰酶消化法对痰标本进行处理，再行FQ-PCR检测，既提高了检出率，同时使定量结果更趋于准确。现报道如下。1材料方法 1.1痰标本 取自本院肺科及市肺科医院的肺结核或拟诊肺结核病人。 选择、清洗和灭菌处理一批带盖样本盒，交由护士并嘱病人自行留取痰标本。要求：①病人晨起后漱口，深咳出1-2口痰入样本盒，加盖送检。 ②样本应避免混入唾沫。 ③涂片镜检应有大量上皮细胞及尘细胞，否则重留。 1.2试剂 胰酶：上海化学试剂公司； 2%NaOH:自配； 25mmol/LcaCL2:自配； FQ-PCR试剂盒：由深圳达尔安生物工程有限公司提供配套试剂盒，含DNA提取液，阴、阳性、临界值对照，定量样模（拷贝数为107/拷贝/mL）。 1.3仪器 DNA扩增仪：日本Biometra型DNA扩增仪； 微量荧光检测仪：广州达安DA-620型微量荧光检测器； 分析软件：上海棱光技术有限公司DA-620数据处理软件包。 1.4方法 1.4.1胰酶消化液配制称取10g胰酶溶于200mL蒸馏水（5%）用2%NaOH调pH至8.0，加25mmol/LcaCL22mL，混匀后成以悬液。40C保存，用前370C水箱温育10分钟。 1.4.2痰标本消化处理初步估计痰标本量，加入等量混匀的胰酶悬液，用消毒棉签搅动痰液，使两者充分接触，静置30分钟至充分液化无痰丝，吸取0.5mL入Eppendorf管中,10000r/min离心5分钟，弃上清液，沉淀加生理盐水1mL。振荡洗涤沉淀后10000r/min离心5分钟。如此2次，弃上清液，沉淀用作TB-DNA提取（剩余消化痰液用移液器定容）。 1.4.3TB-DNA提取沉淀物中加试剂盒所配DNA提取液50uL，振荡混匀，沸水浴10分钟，10000r/min离心5分钟，上清液用于DNA扩增。 1.4.4FQ-PCR检测取上清液2uL入DNA扩增管中，5000r/min离心数秒，上机扩增，扩增参数：930C120S预变性，然后按930C45S→550C120S先行10个循环，测定荧光值F1，再进行30个循环，测定荧光值F2并求出特异性荧光强度△F。 1.4.5阴、阳性判断根据试剂盒说明书，阴性对照荧光强度△F记为N，临界值对照记为P1，检测标本记为P，当P＞（P1-N）×0.6+N时为阳性；当P＜（P1-N）×0.4+N时为阴性；介于二者之间为处于灰度区，应再次进行扩增，若P＞（P1-N）×0.4+N时为阳性；反之为阴性。 2结果 2.1胰酶的溶解性 分别按1%、2%、5%、10%的浓度配制胰酶悬液（pH7.5，含CaCL2），并按1