准确计数血小板方法学研究进展.doc

PAGE PAGE 1 准确计数血小板方法学研究进展 准确计数血小板方法学研究进展 南京军区福州总医院全军医学检验中心朱忠勇 近年来，准确计数外周血中的血小板，已成为血液学和检验医学界的热门话题，其原因有二：一是临床上需要输血小板者日益增多，仅在美国，每年输血小板就达700多万单位以上。由于输注血小板价格高昂，且易发生免疫性输血反应和存在感染的风险，故英、美等国，近年来纷纷提出降低输血小板的起点（triggerpoint）或门（threshold），由过去的20×109/L降至10×109/L，甚至5×109/L，因此迫切要求准确计数血小板。二是迄今为止，所有计数血小板的方法，对于血小板减少的标本，其准确性都比较差，亟需研究改进。 准确计数血小板实非易事。血小板体积小、无色、易粘附。当血液自血管破损处流出时，血小板一经与破损的血管内皮细胞及组织成分接触，立即以极快的速度粘附于破损的血管壁。因此，无论用何种方法采血，所数得血小板数，均较血中实际血小板数为低，皮肤穿刺采血比静脉穿刺更低。此外，血小板易发生聚集，通常我们在血涂片或骨髓涂片上所见到的血小板，很多是几个聚集在一起的，制片耽搁时间越长，聚集越多。更重要的是，目前所有的血小板计数方法，都存在不少缺陷。 世界卫生组织（WHO）推荐的血小计数方法，有人称它为国际参考方（下称参考方），是用Ig/dl的草酸铵溶液作溶血-稀释剂，在相差显微镜下，用血细胞计数板肉眼计数。和一切手工计数法一样，该法除了细胞在计数板上散布的天然误差之外，最大的缺点是计数的血小板太少。例如，一个重度血小板减少的患者，如果血小板计数为10×109/L，实际上在镜下只数到10个血小板，复性很差。据Harrison称，这一方法在不同的操作者之间的变异系统（CV）可达10%-25%。自动化的，无论是阻抗法还是光散射法，对于血小板数及形态正常的标本，结果一般比较可靠，但对于血小板明显减少和/或形态异常者，所得结果误差甚大，有时甚至难以计数。其原因是：这些方法基本上都是依据细胞的近似血小板的所谓“非血小板颗粒”（nonplateletparticles,简称NPPs），如小红细胞、红细胞碎片、白细胞碎片、细菌和真菌以及免疫复合物等，会被当作血小板加以计数，从而使血小板数假性增多。Hammerstrom在一例急性髓细胞白血病（M5型）合并DIC患者的外周血片中，发现大量大小近似血小板的小体。经用细胞化学染色、免疫组化染色等多种方法鉴别，发现其中约1/3与白细胞反应相同；继用抗血小板抗体作免疫组化染色，仅4%呈阳性。证明这种物体，大多数是白细胞或红细胞碎片而非血小板。另一方面，正常人血小板体积相差甚大，可自2fL至20fL以上。其体积分布直方图不是对称的，而是明显地向右延伸，即都存在一定数量的大血小板。在病理情况下，如原发性血小板减少性紫癜、急性心肌梗塞、糖尿病等，大血小板会增多。由于大部分不能将大血小板与小红细胞等分开（只能提示可能有大血小板存在），致使许多大血小板被当作红细胞而未计入血小板总数中，从而使血小板计数结果偏低。 由此可见，要想在日常用的血液分析仪上，用一般方法，达到准确计数血小板是不可能的，必须另辟蹊径。 目前已报道的准确计数血小板的方法，大体上有两大类。一是免疫学方法，即用荧光标记的抗血小板抗体，特异地着染血小板，在流式细胞仪（FMC）或特定的血液分析仪上计数血小板。二是用二维激光散射（two-dimensinallaserlightscatter）测定法，将血小板与NPPs分开，达到准确计数，现分述于下。 1.免疫学测定法 本法早在1988年即由Aulter提出，但最近几年才深入研究并见诸实用。Dickerhoff(1995)和Matzdorff(1998)应用荧光标记抗血小板膜糖蛋白抗体，用FCM法计数血小板；Davis(1999),Gill(2000)和Harrison(2000)等进一步完善了这一方法。所用的单抗，早期是抗CD41或CD42b，近来多用抗CD61，三种单抗效果相同。FCM方法都比较复杂，一般是先在流式细胞仪上计数着染荧光的血小板和计数红细胞，先求出血小板/红细胞之比值（下称血小板比率），再用普通血液分析仪计数同一患者的红细胞数。然后以血小板比率×红细胞数=血小板数。Dickerhoff则改用已知其浓度的荧光微球代替红细胞，先求出血小板/荧光微球之比值，再乘以荧光微球的浓度，即得到血小板数。上述方法都比较麻烦，荧光微球价格高昂，难以在常规作中推广使用。为此，Gill等改在Abbott公司的CELL-DYN4000型血液分析仪上，直接计数着荧光的血小板，完全省去FCM法要先求血小板比率的步骤。由于用的是现成的仪器，而一般的血液分析仪，都已有一套成熟的操作、校准和质控系统，