基于直接电子传递型电化学免疫传感器和微孔板式化学发光免疫分析法快速检测骨肉瘤耐药相关蛋白的分析-外科学(骨外)专业论文.docxVIP

福建医科大学博士研究生毕业论文 福建医科大学博士研究生毕业论文 PAGE PAGE 4 RIA Radio-immunoassay 放射免疫分析法 CLIA Chemiluminescence immunoassay 化学发光免疫分析法 CL Chemiluminescence 化学发光 RLU Relative light units 相对发光强度单位 基于直接电子传递型电化学免疫传感器和微孔板式化学发光免疫分 析法快速检测骨肉瘤耐药相关蛋白的研究 摘要 骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于青少年，恶性程度高，早期 即可发生转移，预后差，是严重危害青少年身心健康的恶性肿瘤。近年来，随着 新辅助化疗、手术等综合治疗的发展，骨肉瘤的五年生存率逐渐上升到 60%~70%。但是，仍有不少的患者因肿瘤复发、转移而导致治疗失败，其主要 原因是肿瘤细胞对化疗药物产生的多药耐药。 骨肉瘤耐药性与其耐药基因表达的标志性耐药蛋白密切相关，通过检测骨 肉瘤标志性耐药蛋白，对骨肉瘤病理学分级、化疗过程中的药物监测、疗效评估、 快速筛选适合患者的抗肿瘤药物有着极其重要的作用，并可为临床上实现个体化 化疗和预后判断提供科学的实验依据。 目前用于骨肉瘤标志性耐药蛋白的临床监测方法主要包括酶联免疫吸附法 （ELISA）、免疫组化染色法、基因芯片、RT-PCR 等技术，但这些方法均存在一 定的局限性，如敏感性不高、操作繁琐、周期长、费用高等问题，迫切需要开发 研制一种快速、简便、灵敏、准确、经济的骨肉瘤耐药相关蛋白检测技术，电化 学免疫传感器技术及化学发光免疫分析技术为解决这一难题提供了新的出路。 本文设计并研制了两种电化学免疫传感器和一种化学发光免疫分析技术， 成功实现了骨肉瘤相关耐药蛋白（肿瘤坏死因子-α 和金属硫蛋白-3）检测，为 临床提供了新型的检测手段，有助于实现临床上骨肉瘤化疗过程中的实时药物耐 药监测，以便及时调整化疗方案，实现骨肉瘤的个体化化疗，大大改善患者的预 后。全文共分为三部分，分述如下： 第一部分：基于铁氰化钾作为指示信号的免标记电化学免疫传感器用于肿瘤坏 死因子 α( TNF-α)的超灵敏检测 本 章 节 主 要 以 K3[Fe(CN)6] 作 为 免 标 记 电 化 学 信 号 物 质 ， 构 建 了 nafion/K3[Fe(CN)6]-壳聚糖-戊二醛（K-CS-GA）复合物修饰的电化学免疫传感器， 根据抗原-抗体反应原理，用于肿瘤坏死因子（TNF-?）的精密检测。利用扫描 电子显微镜（SEM）、循环伏安技术（CV）和荧光倒置显微镜等对修饰电极的制 备过程进行表征，以及利用紫外可见分光光度法（UV-VIS）和红外分光光度法 （FTIR）对制备的修饰复合物 K-CS-GA 溶液进行表征。实验结果表明，在最佳 实验条件下，该方法所制备的 nafion-K-C-GCE 免疫传感器具有较强的生物大分 子识别能力，具有较高的灵敏度和较宽的检测范围，用于检测 TNF-?的线性范围 为 0.02~34 ng/ml，其检测限为 10pg/ml，用于骨肉瘤血清样本测定结果令人满意， 并且该免疫传感器合成方法简单易行，所用修饰复合物 K-CS-GA 溶液廉价易得 并且具有长期稳定性。因此，该电化学免疫传感器具有广阔的临床应用前景。 第二部分：建立基于 K3[Fe(CN)6] 氧化还原信号和 C-dots/nafion 薄膜固定抗体 的电化学免疫传感器用于金属硫蛋白(MT-3)的检测 本章节通过滴涂方式，构建了 C-dots/nafion 和 K-CS-GA 复合物修饰的电化 学免疫传感器，以 K3[Fe(CN)6]作为电化学氧化还原信号来源，通过应用 C-dots 对差分脉冲伏安曲线氧化峰电流信号进行放大，并且以免疫反应为基础，用于金 属硫蛋白（MT-3）的精密测定。该方法先将电化学信号活性复合物 K-CS-GA 和 C-dots/nafion 复合物依次修饰在处理好的电极上，再将捕获抗体组装在修饰 C-dots/nafion 复合物薄膜的电极表面，利用差分脉冲伏安技术，通过对比抗原- 抗体反应前后检测电流变化的大小来检测目标物质。实验结果表明，在最佳实验 条件下，该免疫传感器具有较好的特异性，测得 MT-3 的浓度线性范围为 5 pg?mL-1~20 ng?mL-1，其检测限为 2 pg?mL-1，明显低于目前已有的检测 MT-3 方 法的检测限，检测骨肉瘤血清样本的结果与酶联免疫吸附试验（ELISA）的检测 结果比较没有显著性差异，结果令人满意。 第三部分：微孔板式化学发光免疫分析法测定人血清中肿瘤坏死因子 α( TNF-α) 本章节建立了一种基于微孔板的化学发光免疫分析方法，用于检测人血清中 的肿瘤坏死因子α。该方法具有灵敏度高、特