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蛋白质结构的研究技术 1.X射线单晶衍射分析技术 2.核磁共振技术 3.蛋白质的二维结晶及三维重构技术 4.蛋白质溶液构象的光谱技术 5.扫描探针显微镜技术 6.交联质谱技术 7.分子模拟技术 X射线单晶衍射技术的原理 当一束X射线照射到晶体上时，X射线在晶体中产生衍射现象。晶体所产生的衍射花样都反映出晶体内部的原子分布规律。 X-衍射技术的原理 若用照相法收集衍射线，则可使胶片感光，留下相应的衍射花样(衍射光斑、衍射光环或衍射线条) 。 X射线晶体衍射分析（X－ray Crystallography）主要包括以下五个步骤： 1）晶体培养 2）数据收集和处理 3）测定相位 4）电子密度图的计算和解释 5）结构模型修正 1）晶体培养。 结构测定的精度依赖于晶体所能达到的衍射分辨率，所以获得具有强衍射能力的晶体是蛋白质晶体结构测定分析的关键步骤，是蛋白质晶体结构分析的瓶颈。 2）数据收集和处理 一般来讲，中等大小晶胞的一套高分辨率数据，至少要收集几万个衍射强度数据，再经过专门的数据处理程序包处理，给出这一套数据的各种统计结果，以判断数据质量的好坏。 3）电子密度图的计算和解释 有了每个衍射点的相位，加上已经收集到的每个衍射点的结构振幅，就可计算电子密度图。由于蛋白质分子结构的复杂性，它的电子密度图随着分辨率的不同，从图上能识别出的结构层次也不同。 4）结构模型修正 从电子密度图上最初建立的蛋白质分子结构模型是比较粗糙的，需要进一步精华。 X-衍射技术在蛋白质研究中的应用 英国生物化学家肯德鲁（John Cowdery Kendrew）和佩鲁兹（Max Ferdinand Perutz），用X-射线衍射分析法研究血红蛋白和肌红蛋白，而且共同研究X-射线衍射晶体照相术，以及蛋白质和核酸的结构与功能。 1960年，他们把一些蛋白质分子和衍射X-射线效率特别高的大质量原子（如金或汞的原子）结合起来，首次精确地测定了蛋白质晶体的结构。肯德鲁和佩鲁茨分享了1962年的诺贝尔化学奖。 X-衍射技术在蛋白质研究中的应用 莱纳斯.鲍林（Linus Carl Pauling）将X-射线衍射晶体结构测试的方法引入到蛋白质结构测定中，并且推导了经衍射图谱计算蛋白质中重原子坐标的公式。至今，通过蛋白质结晶进行X-射线衍射实验仍然是测定蛋白质三级结构的主要方法，人类已知结构的绝大部分蛋白质都是经由这种方法测定获得的。 结合血红蛋白的晶体衍射图谱，鲍林提出蛋白质中的肽链在空间中是呈螺旋形排列的，这是最早的α螺旋结构模型。 X-衍射技术在蛋白质研究中的应用 2000年，美国科学家阿格雷（Peter Agre）与其他研究人员应用场发射电子源的电子衍射方法得到分辨率为3.8埃的AQPl 水通道电子密度图，发现了一种被称为水通道蛋白的细胞膜蛋白就是人们寻找已久的水通道，并公布了世界第一张水通道蛋白的高清晰度立体照片。 阿格雷和麦金农因为对膜蛋白分子和离子通道开创性的研究，而共同分享了2003 年的诺贝尔化学奖。 核磁共振技术 核磁矩不为零的核在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂，共振吸收某一特定频率的射频（RF）辐射，这一物理过程就是核磁共振。 满足共振条件可以有两种方法 一是固定电磁波的频率而逐渐改变外加磁场，称为扫场 另一种是固定磁场而改变电磁波的频率，称为扫频。 目前应用最广的是脉冲傅立叶变换的核磁共振技术。即应用一个短时间方波脉冲激发样品，这种方波中包含各种不同的频率在内，因此样品中不同的核可在同一时间内都得到激发。但是脉冲过后得到的是指数衰减的时域函数，借助Fourier变换的数学方法把时域函数转换成频域函数，这时就能见到已经产生的若干共振峰，这种变化过程可以由计算机自动完成。 一维核磁共振只能测定小分子的结构如氨基酸，要测定大分子物质就需要利用二维核磁共振以及多维核磁共振。 一维核磁共振是在一个脉冲之后的t1时间进行数据收集 二维核磁共振在t1时间后再加一个脉冲后在t2时间内收集数据S（t1，t2），然后分别以t2和t1为变量进行傅立叶变换就得到二维谱S（w1，w2）。二维谱就是把作为对角线的一维谱的峰进一步分开。 核磁共振应用于测定蛋白质三维结构 950年，Proctor等人研究发现：质子的共振频率与其结构（化学环境）有关。在高分辨率下，吸收峰产生化学位移和裂分，由有机化合物的核磁共振图，可获得质子所处化学环境的信息，进一步确定化合物结构 1971 年，比利时科学家J. Jeener 提出二维核磁共振的概念 1985年，Kurt Wüthrich在此基础上发明了一