植物组织中叶绿体基因的提取与扩增.PDF

实验名称 植物组织中叶绿体基因的提取 与扩增 紫金港校区化学实验中心105 yaobo08@ 个人主页 /bobodaisy 课件资料下载 口令：biochem 实验目的 初步掌握三种实验技术的原理及操作 • DNA提取 • PCR • 凝胶电泳 Arne Wilhelm Kaurin Tiselius Kary B. Mullis 1/2 of the prize Tiselius(1902--1971 ) –Uppsala， USA La Jolla, CA, 1944-date 1948 Nobel prize laureate for his invention of the polymerase for his research on chain reaction (PCR) method electrophoresis and adsorption analysis, especially for his discoveries concerning the complex nature of the serum proteins 植物DNA提取技术 SDS CTAB 硅胶柱 植物基因组DNA－CTAB法  CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）  CTAB （十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。  该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl ）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加 入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于 15℃。 CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl EDTA  组份 （pH8.0） （pH8.0） NaCl CTAB β-巯基乙醇 0.1% （V/V ） 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/V) 使用前加入  Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；  EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；  NaCl 溶液调节CTAB-核酸的溶解度, 高盐溶解，低盐析出  CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；  β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变， 使酚容易去除  CTAB法流程图 植物材料 裂解液 酒精沉淀 液氮研磨 抽提 离心洗涤 DNA溶液 细胞裂解 上层溶液 干燥溶解 动物基因组DNA－SDS法  SDS法原理  SDS是一种阴离子去垢剂，在高温 （55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；  提高盐(KAc或NH Ac)浓度并降低温度 （冰浴），使蛋白质及多糖