哈萨克绵羊MHC包虫病抗性、非抗性个体细粒棘球六钩蚴侵染期小肠差异表达基因的分离-动物遗传育种与繁殖专业论文.docxVIP

Isolation of differentially expressed genes in small intestine of Kazakh sheep with the genetypes of MHC associated with hydatidosis resistance and nonresistance infected by Echinococcus oncosphere A Dissertation Submitted to Shihezi University In Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Agriculture By Xinli Du (Animal Genetics and Breeding) Dissertation Supervisor: Prof. Bin Jia June，2012 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除 文中已经注明引用的内容外 ，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 学位论文版权授权书 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主 管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索。有权将学位论文的标题 和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 I I 摘 要 棘球蚴病(Echinococcus hydatid disease)即包虫病(Hydatid disease)，是制约新疆绵羊 产业发展的主要疾病之一，同时其又是一种人畜共患病，对牧民的身体健康也构成了严 重威胁。主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)是由许多紧密 连锁、高度多态的基因位点组成的染色体上的一个基因系统，因其高度的多态性和在抗 原递呈中的重要作用，成为疾病相关基因研究的热点之一，已证实人 MHC 的多态性与 多种疾病具有相关性。在绵羊 MHC 研究方面，本试验室即在前期研究中筛选出了哈萨 克绵羊细粒棘球蚴病抗性、非抗性相关的 MHC 基因单倍型，并进行了初步的验证。但 对此抗性相关 MHC 基因单倍型哈萨克绵羊个体抗包虫的分子作用机制尚不知晓。为此， 本试验在此前期研究的基础上，采用抑制性消减杂交技术构建了哈萨克绵羊 MHC 抗性、 非抗性个体，细粒棘球六钩蚴小肠侵染期小肠组织的消减文库，并对差异表达基因进行 了初步分析，为进一步揭示哈萨克绵羊 MHC 包虫病抗性相关基因单倍型个体抗包虫的 分子作用机制提供研究基础。结果如下： 1、依据试验室前期研究中，采用 PCR-RFLP 技术获得哈萨克绵羊细粒棘球蚴病抗 性、非抗性相关 MHC 基因单倍型的方法，对 250 只哈萨克绵羊进行了分析，筛选出了 细粒棘球蚴病抗性和非抗性相关 MHC 基因单倍型的哈萨克绵羊 14 只和 22 只。进一步 对筛选出来的绵羊个体进行了细粒棘球蚴抗体的 ELISA 检测和肝脏部位的 B 超探测， 选取 ELISA 检测结果为阴性同时 B 超探测肝脏部位无包囊的抗性和易感性个体各 3 只。 以每只绵羊饲喂约 5000 个成熟细粒棘球绦虫虫卵进行人工感染，建立了 MHC 包虫病 抗性、非抗性哈萨克绵羊细粒棘球蚴六钩蚴侵染期模型。 2、采用抑制性消极杂交技术建立了 MHC 包虫病抗性、非抗性哈萨克绵羊细粒棘 球蚴六钩蚴侵染期小肠组织的正反向消减文库。以管家基因 GAPDH 进行了消减效率的 检测，两个文库的消减效率均达到了 25 以上，提示所建文库的质量较好，能够用于后 续的进一步分析。 采用菌液 PCR 技术对正向（抗性相关组为 Tester）和反向（非抗性组为 Tester）消 减文库中的阳性克隆进行了分析验证，结果显示，插入片段大小均在 150bp-1000bp 之 间，符合实验预期。又分别从正反向文库中随机挑选了 57 个和 45 个的阳性克隆（单一 条带，且大小大于 150bp）进行了测序分析。分别获取了单一 EST 序列 43 个和 40 个。 通过 NCBI 数据库的 Blast 功能对所获 EST 序列进行了同源性分析。 采用实时定量 PCR 技术，对 3 个 EST 序列(IgM-VH、PLA2G2A 和 FTH1)在抗性