瓜类细菌性果斑病菌及辣椒细菌性斑点病菌的快速检测技术研究-植物病理学专业论文.docxVIP

山东农业大学硕士学位论文 山东农业大学硕士学位论文 瓜类细菌性果斑病菌及辣椒细菌性斑点病菌的快速检测技术研究 瓜类细菌性果斑病菌及辣椒细菌性斑点病菌的快速检测技术研究 PAGE PAGE 1 PAGE PAGE 2 摘 要 植物病原细菌可导致多种严重的植物病害，引起多种农作物、花卉及林木等植物产 量、质量等严重受损甚至绝产，因此，任何快速、准确的检测植物病原细菌的方法对防 止该病害的发生、流行等环节都是有意义的。 瓜类细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp. citrulli，Aac）是西瓜、甜瓜及哈密 瓜等瓜类作物上重要的植物病原细菌，可导致西瓜等作物严重减产甚至整株死亡，在美 国被称为西瓜的“癌症”，是典型的种传病害，被列为我国进境植物检疫性有害生物之一。 目前，该病害已在我国境内部分地区发生，且危害严重，探索快速、有效的检测瓜类果 斑病菌的方法迫在眉睫。 番茄及辣椒细菌性斑点病（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria，Xcv）是番茄及 辣椒上重要的病原菌之一，是典型的种传病害，危害十分严重。该病菌广泛分布于亚、 非、欧、美等部分国家和地区，被欧洲及地中海植物保护组织列为 A2 类检疫性有害生 物，建立特异、灵敏的检测技术对保证我国辣椒进出口贸易安全意义重大。 本研究中，利用 GICA-PCR 技术和实时荧光 PCR 技术分别对瓜类细菌性果斑病菌 和辣椒细菌性斑点病菌进行了检测研究，主要研究内容如下： （1）胶体金免疫层析试纸条检测方便、快捷，整个反应仅需几分钟时间，应用十 分广泛，但试纸条若使用不当可能会出现假阳性现象，仅适用于对病原菌的初筛。本研 究将胶体金免疫层析方法（GICA）与 PCR 技术结合，建立了 GICA-PCR 检测 Aac 病菌 的方法。检测结果表明，该方法在蛋白质与核酸两个方面，提高了瓜类果斑病菌试纸条 检测的准确性和灵敏度，有效解决了试纸条检测的假阳性问题，并可以从发病的西瓜叶 片上检测到果斑病菌。因此，所建立的 GICA-PCR 方法值得在口岸局检测中推广和应用。 （2）实时荧光 PCR 较普通 PCR 方法特异性强、灵敏度高，节省了反应结束后的电 泳的步骤，避免了溴化乙锭或其他核酸染料的污染，并可实时观察扩增反应的产物量变 化。本研究针对辣椒寄主的 Xcv 病菌 rhs 家族基因的序列片段，设计了一对引物及探针 XCV-F-F/R/P，特异性检测辣椒细菌性斑点病菌。所建立的实时荧光 PCR 检测体系扩增 Xcv 基因片段的长度为 71 bp，最低可检测菌液的浓度为 9×103 cfu/ml，检测 DNA 的极 限浓度为 2.8×104 copies/ml，二者灵敏度相似，且均比普通 PCR 的灵敏度高约 10 倍。 经实验可证明，该荧光 PCR 体系可以达到特异性检测受侵染的辣椒植株及种子的要求， 适合作为快速、可靠地检测被 Xcv 侵染样品的方法。 本文所建立的 GICA-PCR 及实时荧光 PCR 检测体系，经实验证实快速、灵敏、准 确，解决了上述两种细菌在实际检测中的技术难题，可以在相关部门推广，有助于保证 我国生态环境及进出口贸易安全。 关键词：细菌性果斑病; 细菌性斑点病; 快速检测; GICA-PCR; 实时荧光 PCR Rapid detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Abstract Phytobacteria is one of the most damaging plant pathogens, which can make the yields lost in crops and deterioration in quality in flowers and woods seriously. Bacterial fruit blotch (BFB), one of a bacterial deisease in cucurbits, is a seed borne disease caused by Acidovorax. avenae subsp. citrulli (Aac). This species of bacteria can infect melon, watermelon, cantaloupe and other cucurbits and cause devastating lost in fruits. It has been holding as a quarantine pest in China because of its dis