过表达bldD基因对红色糖多孢菌红霉素产量及孢子形成的影响-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

过表达 过表达 bldD 基因对红色糖多孢菌红霉素产量及孢子形成的影响 I I 过表达 bldD 基因对红色糖多孢菌红霉素产 量及孢子形成的影响 摘要 红霉素（erythromycin）是一类具有广谱抗菌效果的大环内酯类抗生素，由革 兰氏阳性菌红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea，也称糖多孢红霉菌）产 生。红霉素在临床上应用非常广泛，所以提高红霉素产量具有重要意义。红色糖 多孢菌中红霉素产量受多种因子影响，已发现多个基因可影响红霉素的生物合 成，2008 年在红霉素高产菌株中发现 bldD 基因是红霉素合成的正调控基因。正 调控基因在目的链霉菌中过量表达可获得抗生素高产菌株，此种方法已发展的较 为成熟。所以在本研究中我们进一步在红色糖多孢菌 A226 中过表达 bldD 基因， 以期获得红霉素高产菌株，并探讨过表达 bldD 基因对红色糖多孢菌形态分化过 程的影响。 本实验首先通过基因工程方法成功构建了可在红色糖多孢菌中表达的整合型 质粒 pZMW-bldD 质粒。为了检测该质粒在红色糖多孢菌中的活性，将其在 PEG 介导下转入红色糖多孢菌突变株 A226-△bldD 中，该突变株是由本实验室构建的 红色糖多孢菌 bldD 基因突变菌株，其产红霉素水平明显降低且丧失产孢能力。 通过安普抗性筛选及 PCR 鉴定获得一株 pZMW-bldD 质粒在突变株 A226-△bldD 中转化成功的阳性菌株，即红色糖多孢菌 A226-△bldD/bldD 。同时接种 A226-△bldD/bldD、A226-△bldD 及对照菌株 A226 到 TSB 液体培养基中发酵 120h ，运用高效液相色谱分析各菌株 发酵液中红霉素含量，发现菌株 A226-△bldD/bldD 产红霉素水平可提高到接近正常菌株的产红霉素水平。同时将 上述菌株接种到 R3M 固体培养基上，30℃恒温培养，比较这几株菌株的孢子形 成情况，发现在回补菌株 A226-△bldD/bldD 中孢子形成能力得到恢复。这表明 pZMW-bldD 质粒可在红色糖多孢菌体内成功表达，这为下一步的研究奠定了基 础。 与上述方法类似本实验进一步在正常菌株 A226 中引入质粒 pZMW-bldD， 鉴定并获得 bldD 基因过量表达菌株 A226/bldD。将菌株 A226 及 A226/bldD 同时 摘要 摘要 II II 接种到液体 TSB 培养基和固体 R3M 培养基上，比较这两个菌株的产红霉素水平 及产孢情况的差异，发现菌株 A226/bldD 与 A226 产红霉素水平相比可提高 20％， 同时菌株 A226/bldD 较之 A226 产白色孢子的时间提前 1-2 天。 本实验通过增加红色糖多孢菌调控基因 bldD 的拷贝数，成功构建了红霉素 高产菌株 A226/bldD，将该高产菌株运用于实际生产可有助于提高红霉素产量。 同时在本实验中也发现 bldD 的拷贝数对红色糖多孢菌产孢时间也有影响，含有 高拷贝 bldD 基因的菌株产孢时间可提前，这为进一步研究红色糖多孢菌的形态 分化奠定了基础。 关键词：红色糖多孢菌；红霉素；bldD；孢子；过表达 ABSTRACT ABSTRACT PAGE PAGE IV Effect of bldD Gene Over-expression on the Erythromycin Output and Spore Formation of Saccharopolyspora erythraea ABSTRACT Erythromycin is a kind of macrolide antibiotics with a broad spectrum of anti-bacterial, which is produced by gram positive bacterium Saccharopolyspora erythraea. It has been widespread used in clinical, so, it is necessary to improve the production of erythromycin. It was found that many factors could influence the production of erythromycin in Saccharopolyspora erythraea, and the biosynthesis of erythromycin was influenced by many genes. bldD was one of those genes, which was found to be a regu