海藻中两种与植物抗病相关铜结合蛋白的分离、特性和基因特征-农药学专业论文.docxVIP

福建农林大学博士学位论文 福建农林大学博士学位论文 摘要 摘要 一直以来，人们与植物病害的斗争就没有停止过。从生物中探寻具有抗 病活性的天然产物并将其应用于人类防治植物病害的实践，是科学家所关注 的一个重要课题。海藻因其特殊性，其中的活性蛋白质及其编码基因也必然 具有特殊性。因此研究海藻中与抗植物病害相关的蛋白质及其基因就有其重 要意义。 1．测定了16种海藻蛋白浸提液的抗病毒和抗真菌作用，发现海藻中存 在着对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和马铃薯Y病毒坏死株 系(Potato virusY，strainN，pvyTM)的侵染以及真菌生长具有抑制作用的 蛋白质，且具有多种蛋白质组分，其抑制作用大小不一。并发现有7种供试 海藻存在着对Gloeosporium musarum孢子的萌发具有抑制作用的蛋白质。 采用(Nmhs04盐析，阴离子或者阳离子交换柱层析，以及凝胶过滤层 析等步骤，将羊栖菜(Sargassumfusiforme)、沙菜(Hypnea cervicorrnis)、半 叶马尾藻(Sargassum hemiphyllum)蛋白进行了部分纯化，得到了不同的蛋 白质组分，发现其中含具有抗TMV侵染和真菌生长以及抑制真菌孢子萌发 的活性蛋白组分。 2．在活性蛋白初筛的基础上，重点选择了孔石莼(Ulvapertusa Kjellm) 作为进一步开展抗病毒活性蛋白纯化的对象。通过DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换柱层析和Sephadex G--75凝胶过滤层析，从40％～80％的孔石莼硫 酸铵盐析蛋白中获得了一种具有抗PVy“活性的蛋白，该蛋白不含糖，SDS —PAGE电泳显示，其分子量约为10，000Da，将其命名为UPG75。将该蛋白 N端氨基酸测序，获得了其前20个氨基酸序列，并登录SWISS PROT蛋白 质数据库，登录号为：P56274。经同源性检索，发现，该蛋白前20个氨基酸 序列与海藻中的质体蓝素(plaztocyanin)氨基酸序列高度同源，同源性达85 ％以上。认为该蛋白为质体蓝素家族的成员。质体蓝素是一种含铜离子的蛋 白，其在植物的电子传递过程中起着重要作用。 孔石莼40％～80％硫酸铵盐祈蛋白在采用CM Sepharose Fast FloW阳离 子交换柱层析时，纯化得到一个对TMV侵染具有抑制作用的蛋白，当浓度 为50 p e,／mL时，该蛋白在心叶烟上对TMV侵染的抑制率达85．6％。该蛋白 可能是一个碱性蛋白，经SDS确定其分子量约为36，000Da，单一亚基， 不含糖。命名该蛋白为UPCM40。 福建农林大学博士学位论文 福建农林大学博士学位论文 摘要 3．多酚氧化酶(PPO)是一种与生物的抗病性密切相关的酶，同时也是 一种重要的含铜离子金属蛋白。经测定，发现PPO活性在海藻中广泛存在。 以邻苯二酚为底物，系统测定了羊栖菜、铁钉菜、孔石莼中40％～80％ 硫酸铵盐析得到的PPO酶溶液的特性，在以邻苯二酚为底物的体系中，存在 着一个适宜的底物和酶液的比例，底物浓度过高，往往会产生底物抑制的现 象。3种海藻PPO都具有较广的适温范围和一定的热稳定性，NariS03、L一 半胱氨酸、抗坏血酸、EDTA、NaCI等对PPO活力均有抑制作用。有趣的是， 所测定的铁钉菜和羊栖菜这2种海藻的PPO活力都表现出一个在较高pH值 时酶活力很高的现象。羊栖菜的最适酶活力pH是9．1，同时在pHll．0、pill2．0 时酶活力依旧很高，并有出现峰值的趋势。而铁钉菜PPO则在pill2．0时， 酶活力表现最大。同时，这两者在酸性条件下，酶活力都很低。pH3．0和pH4．0 时，酶没有表现活力，只有当pH5．0时，羊栖菜多酚氧化酶才表现出一定活 力，但其活力仅仅是酶在pH9．1时活力的1％，在pH6．6时的酶活力是在pH9．1 时酶活力的2．80A；铁钉菜的PPO在VH3．0，4．0，5．0，6．0时，不能检测到酶 活力。 4．采用降落PCR方法并结合RACE技术，克隆得到了对PVY“侵染具 有抑制作用的UPG75的cDNA的全部核苷酸序列。 该基因序列共由787个碱基组成，包括40个碱基的5，UTR和417个碱 基的开放阅读框架(ORF)以及333个碱基的3UTR。该部分ORF编码一个 UPG75的前体肽，共139个氨基酸残基，其中N端41个氨基酸为信号肽序 列，其后98个氨基酸序列为成熟肽。’ 发现，UPG75前体肽的核苷酸序列与同属于绿藻门(Chlorophyta)的斜生 栅藻(Scenedesmusob均uus)(AFll4235)、短棘盘星藻(Pediastrum boryahum) (A