过量合成核黄素的枯草芽孢杆菌的代谢工程-生物化工专业论文.docxVIP

摘要中文摘要 摘要 中文摘要 本论文根据代谢工程理论，重点研究了过量合成核黄素的枯草芽孢杆菌的基 因工程及其碳代谢的全局调节机理，得到如下结果： B．subtilis核黄素生物合成的限制因素不在于5．磷酸核酮糖及3．磷酸甘油酸 等前体物的供给，也不是还原力NADPH的供给，而在于以鸟苷三磷酸为起始物 的生物合成途径中核黄素操纵子的基因剂量及ATP的供给，基因操作的靶点之 一就在于核黄素操纵子，之二在于B,subtilis核黄素生产菌的电子传递链。 用吖啶橙及提高培养温度法不能消除B．subtilis24／f)MX45中的质粒，SDS对 B．subtilis 24／pMX45质粒的消除率为4．1％，原生质体再生法的质粒消除率为12 ％。质粒消除的菌株B．subtilis24A7与原始菌B．subtilis24／pMX45的培养特征基 本相同，但两者的抗生谱有差异。 以pBE2为载体，所构建的带有4．6kb核黄素操纵子的重组质粒pRF46在 EcoliHBl01中成功表达。 将SMMP高渗缓冲液中的M92+用50mM的Ca2+取代并将pH调至7，煮沸 原生质体悬浮液1min，可降低B．subtilis24A7原生质体核酸酶活性。在lmL原 生质体(1×108)转化液中，加入O．05¨,g质粒DNA、30％的PEG6000在4C下 处理4rain后，转化效率最高。 葡萄糖的吸收及磷酸化大多由B．subtilis基因ptsG编码的葡萄糖透性酶EII 完成，分别编码EI与HPr的p埘及p随H形成组成型表达的操纵子。ptsG基因位 于ptsHI操纵子的上游，它是较大转录单元p灯G册的一部分，ptsGHI操纵子受 葡萄糖诱导并受转录反终止子GlcT的控制。 B．subtilis的碳分解代谢阻遏受分解代谢调节蛋白A(CcpA)及具有顺式作 用的分解代谢响应元件的调控。CcpA基因突变能解除B．subtilis及B．megaterium 的许多分解代谢基因及操纵子的分解代谢阻遏。 当葡萄糖浓度大于3％时，B．subtilis核黄索发酵出现葡萄糖分解代谢阻遏效 应，并引起代谢流迁移。发酵液的低pH值抑制了核黄素合成酶的活性，核黄素 产量增加缓慢。以1．5％的葡萄糖流加发酵或以蔗糖代替葡萄糖进行发酵，核黄 索产量较高。 关键词：代谢工程，核黄素，枯草芽孢杆菌，转化，发酵 垒星!翌釜三ABSTRACT 垒星!翌釜三 ABSTRACT Based on the theory of metabolic engineering，the dissertation focuses on the genetic engineering of Bacillus subtilis for overproducing riboflavin and the mechanisms of carbon catabolism by global regulator．The main results presented in this work are as follows： Riboflavin biosynthesis in BaciHus subtil抽is limited neither by the supply of the ribose·5-phosphate and 3-phosphoglycerie acid precursor nor by the supply of the NADPH cofactors，which indicates the bottleneck for riboflavin production resides most likely in ATP supply and gene dosage of riboflavin operon of biosynthetic pathway starting from GTE One target for genetic manipulation lies in the riboflavin operon，another lies in electron transport chain in riboflavin-overproduced B,subfit彝。 While plasmids ofB．subtitis24／pMX45 call not be cured by acridine orange and growth at elevated temperatures，the plasmid elimination rate by SDS and protoplast regeneration method were 4．1％and 12％。respectively．There w