固定化微环境中红豆杉细胞MAPK信号转导过程研究-生物化工专业论文.docxVIP

中文摘要为了更好地研究不同微环境下的植物细胞生长和生产特性，用对细胞无毒的 中文摘要 为了更好地研究不同微环境下的植物细胞生长和生产特性，用对细胞无毒的 聚氨酯泡沫作为载体构建固定化区域微环境。以东北红豆杉细胞为例，通过对细 胞形态、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化、蛋白质表达等的考察，试图从 细胞信号转导角度探索微环境中细胞生长和生产基本规律。 在细胞固定化培养之前，将圆柱形泡沫(半径：7．5mm，高：15ram)从边缘到 中心分成0--3ram和3～7．5mm两个区域。通过考察生长在泡沫表面、泡沫中 0--3ram和3~7．5mm三个区域(外、中、内层)红豆杉有丝分裂指数(MD、细胞分 化、紫杉醇含量的变化，以展示固定化不同区域细胞所处的理化微环境差异。20 天后固定化不同区域细胞的MI表现为：外层中层内层；细胞分化程度和紫杉 醇含量表现为：外层中层内层。 运用免疫荧光技术和Western blot方法考察固定化对细胞壁中信号分子(阿拉 伯半乳糖蛋白，AGPs)表达的影响。发现与普通悬浮培养相比，固定化培养提高 了AGPs的表达水平。20天后内层、中层细胞中AGPs表达比外层和悬浮培养细 胞中的AGPs表达高。AGPs表达上升时，细胞分化程度和紫杉醇产量得到提高。 运用West盯n blot方法考察了固定化细胞中胞外信号调节激酶(ERK)、争Jun N-terminal kina船$(m-K)和p39-like MAPK的磷酸化水平，从信号转导角度揭示 固定化微环境对红豆杉细胞生长和生产的影响机制。发现20天后固定化细胞中 E砌olike MAPK活性表现为：外层中层内层，这些变化与不同区域中营养物 浓度梯度相关。固定化细胞中ERK活性与细胞枷【呈正相关，与细胞分化程度、 紫杉醇生产和AGPs表达呈负相关。同时发现固定化培养提高了细胞中52．kDa JNK-like MAPK磷酸化水平，降低了45-kDa JNK-like和41-kDa p38．1ike MAPK 磷酸化水平。主要是47．kDa和45-kDaJNK的磷酸化参与固定化对细胞的水剪切 力保护，而不是52．kDa JNK或p38 MAPK的磷酸化。 运用二维凝胶电泳和质谱技术，从蛋白质表达水平揭示固定化微环境中红豆 杉细胞生长生产特性。经质谱鉴定后发现部分差异表达蛋白参与调节细胞中氮j 硫和糖类的代谢。固定化培养增强了细胞中UDPG pyrophosphorylase的表达，该 酶直接或间接参与细胞壁多綮的合成。腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)表达增强时， MI增加；S剐ⅥS表达降低时，MI下降。 关键词： 微环境；促分裂原活化蛋白激酶；蛋白差异表达；信号转导；东北红 杉细胞；紫杉醇；固定化培养 ABSTRACTThe ABSTRACT The influences of immobilization microenvironments on the growth and production of plant cells were investigated by immobilizing Taxus cuspidata cells on the non-toxic polyurethane foam．The changes in cellular morphology,protein expressions and phosphorylation level were monitored to study the signal transduction of mitogen-activated protein kinase(MAPK)in Taxus cuspidata ceHs induced by lOCal microenviroaments in immobilized cultures． The cylinder-shaped polyurethane foam(7．5 mm in radius and 15 n-un in height) WaS viewed as consisting of two zones．0-3 rain and 3~7．5 rain from the edge to the centeg respectively．The immobilized cells growing on the foam surface were defined as the outer zone cells．while the cells growing in the zones of 0-3 ITml and 3-7．5 mlTl from edge to center were called as the middle zone c