哈维氏弧菌超氧化物歧化酶的原核表达及免疫原性的研究-细胞生物学专业论文.docxVIP

哈维氏弧菌超氧化物歧化酶的原核表达及 哈维氏弧菌超氧化物歧化酶的原核表达及 免疫原性的研究 学位论文完成日期： A M∥瑚阮 吵 指导教师签字： ∽妙 答辩委员会成员签字： ＼^髁尽 ? ’净珂弼． j移挚 a训弼 ∥弧．．’ 独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特另,JJJrl以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得——或其他教 育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：幸瑞喇滥字日期：)。JJ年岁月J J日 I 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络 向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书) 殳q 签字日期：矽11年f月11日 签字日期：圳1年 移州 ， 坼p 学位论文作者签名：幸嘶仨I耗 导师签字： 哈维氏弧菌超氧化物歧化酶的原核表达及免疫原性的研究摘 哈维氏弧菌超氧化物歧化酶的原核表达及免疫原性的研究 摘 要 哈维氏弧菌是一种有运动性，短杆的革兰氏阴性海洋细菌，由于它有广泛 的寄主范围，所以是日本对虾，海参和各种鱼类等海水养殖动物的重要病原弧 菌。在中国(包括台湾)、泰国、印度、澳大利亚等国家和地区，均有由哈哈维 氏弧菌引起水产养殖动物病害流行的报道，造成了水产养殖巨大的经济损失。 抗生素在养殖病害的防治方面发挥了积极的作用，但是滥用抗生素造成的 药物残留和细菌耐药性等不良后果，限制了其广泛应用。所以人们转向利用基 因工程的方法研究包括DNA疫苗，活载体疫苗，基因工程亚单位疫苗等多种类 型的新型疫苗，这些疫苗安全高效的优势，在鱼类病害防治方面具有很好的应 用前景。 在正常代谢中细胞可以产生内源性的活性氧，而且在应答极端温度、紫外 照射、强光、高渗、毒素等环境压力也会加速它的产生。当ROS的产生和ROS 清除之间的平衡机制破坏，就会出现氧化应激并导致机体损伤。超氧化物歧化 酶(Superoxide dismutase)通过催化超氧阴离子、自由基(02)形成02和H202，作 为一种重要抗氧化酶，是生物体防御氧毒性的第一道防线。超氧化物歧化酶(SOD) 广泛存在于各种生物体内，根据所含金属离子的不同，可以分为Cu，Zn．SOD、 Mn．SOD，Fe．SOD。 本文通过同源引物从哈维氏弧菌SF．1基因组扩增得到了sod基因，将sod 基因克隆至pMD．19T载体测序，并进行序列的生物信息学分析。sod基因全长 600bp，含有完整的基因开放阅读框，编码199个氨基酸组成的蛋白质。氨基酸 序列经过Blast比对，表明溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)40B、副溶血弧菌 (Vibrioparahaemolyticus)K5030的Fe．SOD的序列相似性高达98．99％，与霍乱 弧菌(Vibrio cholerae)V52、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovi／)CIP69．14、拟态弧菌 (Fibrio mimicus)VM603等Fe．SOD的序列相似性分别为91．95％。 将sod基因克隆于pET-26(+)表达载体，构建的阳性质粒在受体菌大肠杆菌 BL2l中进行表达，用l mmol／L IPTG于25℃诱导6 h后，SOD得到了很好的表 达。利用表达的融合蛋白N末端的6个组氨酸的多肽标签，通过镍亲和层析完成 了SOD的分离纯化。SDS．PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，纯化的蛋白为单 一条带，分子量约为27 一条带，分子量约为27 kDa。 采用邻苯三酚自氧化法对SOD酶活分析。酶的最适温度为20℃，最适pH 为7，是一种对热敏感的低温酶，在10．30℃的温度范围内酶活力稳定，温度 超过40℃时酶的活力明显丧失，60℃处理1 h后酶活力剩余为3％。酶在pH 6-8 时稳定。对纯化的SOD含有的金属离子类型进行鉴定：纯化的蛋白最大吸收 峰位于280 nm和362 am，具有典型的Fe．SOD吸收光谱；对氯仿．乙醇和H202 敏感，表明该属于Fe．SOD。 纯化的重组SOD蛋白，通过肌肉注射的方式免疫大菱鲆，4周后用致病性哈 维氏弧菌SF．1进行人工感染试验