03-细胞生物学研究方法.pptVIP

思考题： 根据你目前所掌握的知识，在生命科学领域里提出一个你认为是很有意义的问题，并设计出解决该问题的方法。（5分） Microtome arm:ribbon;slip * Scanning mirrors * * Rat Hippocampal neurons * Kinesin 驱动蛋白tubulin微管蛋白 电子显微镜的基本构造 电镜的基本构造主要如下： A：电子束照明系统； B：电磁透镜成像系统； C：真空系统； D：记录系统； 主要电镜制样技术 ?超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 ?负染色技术（Negative staining） 染色背景，衬托出样品的精细结构 ?冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 ?电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology）——主要研究生物大分子空间结构及其关系的主要实验手段。 扫描电镜 ?原理与应用：电子束被磁透镜汇集成极细的电子探针，电子“探针”扫描样品，激发样品表面放出二次电子，二次电子产生的多少与样品表面的形貌有关，探测器收集二次电子成象。二次电子产生的多少，反映在图像上为相应部位亮暗的差异。 ? CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题 一、 离心分离技术 ?用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 ?差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 ?密度梯度离心：用于精细组分或生物大分子的分离。将要分离的细胞组分小心地铺放在密度逐渐增加的、高溶解性的惰性物质溶液表面，通过离心力的作用使样品中不同的组分以不同的沉降率沉降，从而形成不同的沉降带。 各组分的沉降率与它们的形状和大小有关。 二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法 ?原理： 利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。 例：DNA的Feulgen反应显示法 1924年， Feulgen 和Rossenbeck发明。 原理：盐酸水解，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，出现醛基，试剂中的无色品红与醛基反应，呈现紫红色。 例： PAS（高碘酸-席夫反应）──鉴定多糖类物质 高碘酸氧化多糖，游离出的醛基与Schiff试剂反应，生成红色化合物 。 DNA经稀盐酸（1mol/LHCl、60℃下水解）水解后，DNA分子中嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键被打开，嘌呤碱基被解离，在脱氧核糖的一端（脱氧核糖C-1位置）形成了醛基 三、特异蛋白抗原的定位与定性 1、免疫荧光技术： 是根据免疫学原理，利用抗体同特异抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。 抗原主要为大分子或与大分子结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特异的抗原分泌的免疫球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。 （图） ★步骤 荧光抗体制备 标本处理：组织切片、冷冻切片、整装细胞等 免疫染色：抗原-抗体反应 观察记录 ★免疫反应 直接法：Ag + Ab*?镜检（*代表标记物） 间接法：Ag + Ab1 + Ab2*?镜检 ★标记物可以为多种： 荧光素─免疫荧光技术或称荧光抗体法 酶─酶标抗体法（如辣根过氧化物酶） 四、细胞内特异核酸的定位与定性 ?光镜水平的原位杂交技术 （同位素标记或荧光素标记的探针） ?电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合） 　　　　　　 ?PCR技术 五、放射自显影技术 ?原理及应用： ?利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； ?实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 ?步骤： ?同位素标记的生物大分子前体物掺入细胞。 ?放射自显影显示细胞内同位素所在位置。 六．定量细胞化学分析技术 ? 细胞显微分光光度术（microspectrophotometry） ?细胞中有些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线，如核酸的吸收波长260nm