海带配子体中孢子形成相关蛋白SRP基因的克隆与鉴定-海洋生物学专业论文.docxVIP

±渔渔滢太堂博／硕士学位论文答辩委员会成员名单 ±渔渔滢太堂博／硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 觌震饭 钍星久辔 躲 ● 主席 马象杰 上痞癌详磁 教授 委员 乎投努、 上2，丕瘤身如 放扳 委员 ／5互谤尺 上烃；盘磷丈学 麦疋投 委员 委员 委员 委员 糨公 土屈逸珲聪 摒’胁 秘书 答辩地点 ，擀瞳A细男 答辩日期 铘一；。}≥j8：如 E海海洋大学硕士学位论文海带配子体中孢子形成相关蛋白(SRP)基因的克隆与鉴定 E海海洋大学硕士学位论文 海带配子体中孢子形成相关蛋白(SRP)基因的克隆与鉴定 摘要 自己构建好的海带(Laminaria japonica)雄配子体抑制消减cDNA 文库中，通过Southern点杂交及序列分析，发现一未知功能的差异表 达基因片段(克隆b9)。根据该克隆序列设计基因特异性引物，利用 cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)， 白雄配子体中克隆了一条长831 bp的cDNA序列，其中开放阅读框450 bp，5’．非翻译区182 bp，3’．非翻译区199 bp且具有明显的poly(A)尾 巴。它编码含149个氨基酸的蛋白，其分子量为17．2 kD，等电点为 lO．46。同样利用PCR方法自雌配子体中克隆了该基因的cDNA序列， 它与雄配子体中的完全一致。根据srp基因的cDNA序列设计引物， 白海带雌、雄配子体基因组中扩增其DNA序列，经序列分析可知该基 因在ORF区域不存在内含子。这些结果说明srp基因同时存在于海带 雌、雄配子体的细胞中，且在cDNA序列上没有差异。 使用核甘酸序列同源搜索，无匹配。蛋白同源搜索结果显示，该 基因编码蛋白与点形念珠藻(Nostocpunctiforme)含有SpoIID／LytB结 构域蛋白(SpolID／LytB domain．containing protein：一种孢子形成时起 作用的蛋白质)具有30％相似性，故暂命名为孢子形成相关蛋白基因 (spomlation．related protein gene，srp)(GenBank登录号：EF4903 1 3)。 利用生物信息学对SRP蛋白的结构和功能进行了预测，发现组成 它的氨基酸多为中性和碱性，且疏水性氨基酸占41．6％，说明SRP蛋 白具有较强的疏水性。另外，SRP蛋白无信号肽，但它具有N．肉豆蔻 酰基化、cAMP与cGMP依赖型蛋白激酶磷酸化、蛋白激酶C磷酸化、 酪蛋白激酶II磷酸化以及N．糖基化等位点。 在克隆srp基因的cDNA全长序列后，构建了它原核表达载体 pET-28a—srp，并将其转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中，获 上海海洋大学硕士学位论文得了分子量大小约19．3 上海海洋大学硕士学位论文 得了分子量大小约19．3 kD的目的表达蛋白(含His标签)，且表达量 与诱导物IPTG的量成正比。通过高效液相．质谱分析证实，重组蛋白 的氨基酸序列与基于cDNA序列推测蛋白的氨基酸序列一致。 以重组SRP蛋白为抗原对兔子进行免疫以获得多克隆抗体，利用 该抗体并运用Western印迹技术，在海带配子体中证实天然SRP蛋白 的存在。 本研究的结果证实了srp基因所编码蛋白确实存在于海带配子体 细胞中，以发挥相应的作用。有关SRP蛋白在海带配子体生长与发育 过程所起的作用，以及为什么在雌、雄配子体之间存在差异表达等问 题，有待于在配子体SRP蛋白分离及性质分析后，利用RNAi或基因 敲除等手段来进一步探讨。 关键词：海带，配子体，srp基因，原核表达，高效液相色谱．质谱法， Western印迹 上海海洋大学硕士学位论文Cloning 上海海洋大学硕士学位论文 Cloning and identification of srp gene from the gametophytes OI Laminaria lapomca ABSTRACT A male differentially expressed eDNA library subtracted from the female gametophytes of Laminaria japonica was constructed by use of suppression subtractive hybridization(SSH)．A clone b9 was found to be a new differentially expressed gene using Southern dot-blotting．With the designed gene—specific primers on basis of Cl