广西三黄鸡抗马立克氏病相关分子遗传学标记的筛选研究-预防兽医学专业论文.docxVIP

广西大学硕士论文 广西大学硕士论文 广西三黄鸡抗马立克氏病相关分了遗传学标记的筛选研究 酶切和测序鉴定，将目的基因片段成功定向亚克隆于pSP72质粒T7启动子 下游的多克隆位点，经PCR和HindIII、EcoR I双酶切鉴定，采用HindIII 单酶切pSP72．GH重组质粒得到线性化转录模板DNA，在体外以T7 R．NA 聚合酶转录合成，成功制备用于进行核糖核酸酶保护实验(RPA)的GH反 义RNA探针；采用核糖核酸酶保护技术对MD抗性与易感霞烟鸡个体进 行GH基因的mRNA定量表达测定，结果显示MD抗性个体的GH基因表 达水平比易感个体低，且二者之间存在明显差异，从而可以初步的把GH 基因作为MD抗性选育的分子遗传学标记之一。 应用逆转录酶一聚合酶链式反应(ImPCR)逆转录扩增GH基因、B．F 基因和GAPDH基因转录子的cDNA，并将纯化的cDNA亚克隆于pGM-T 载体的多克隆位点。重组质粒DNA经PCR和Hind III、EcoR I双酶切鉴定 及测序分析，证实GH基因、曰。F基因和GAPDH基因成功重组到pGM-T 载体上。将梯度浓度的GH基因、B-F基因和GAPDH基因重组标准品质 粒DNA进行荧光定量PCR，建立标准曲线。经分析显示标准曲线的Ct值 与标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系。动力学曲线分析表明， 在该反应体系和反应条件下，标准曲线的灵敏度都到达10拷贝／反应。结果 表明，实时荧光定量PCR检测GH基因、占．，基因和GAPDH基因表达水 平的标准品质粒和标准曲线构建成功。 本研究的结果表明，MD抗性鸡与易感鸡间的层也曰II基因序列存在明 显的差异；MD抗性鸡与易感鸡在GH基因的表达水平上亦存在明显差异。 因此，可以初步的把曰也丑II基因和GH基因作为MD抗性选育的分子遗 传学标记。此外，本研究还成功构建了实时荧光定量PCR检测GH基因、 占．F基因和GAPDH基因表达水平的标准品质粒和标准曲线，为下一步定 量检测GH基因和岳，基因在不同MD抗性能力霞烟鸡外周血淋巴白细胞 的表达水平奠定了基础。 关键词 马立克氏病 霞烟鸡抗MD分子遗传学标记PCR．RFLP 基因表达核糖核酸酶保护实验荧光定量PCR标准曲线 广西大学硕士论文 广西大学硕士论文 广西三黄鸡抗马立克氏病相关分子遗传学标记的筛选研究 A RESEARCH ON SCREENING MAREK’S DISEASE RESISTANCE．RELATED MoLECULAR GENETIC MARKERS oF THREE．YELLOW CHICKEN ABSTRACT Marek’s disease(MD)is a malignant T lymphoproliferative disease of chicken and has been causing big losses in the poultry industry．Research on the screening of MD resistance—related molecular genetic markers，with the purpose of establishment some corresponding molecular genetic markers，will enhance the resistance breeding of Three—Yellow chicken，and provide a complementary measure to the vaccination and biosecurity strategies for the effective control of MD． A PCR procedure Was developed to amplify exon 2 of major histocompatibility complex B—L B II gene∞-L B II、from the PBL samples of 120 challenged birds，and the PCR products were digested with restriction endonucleidases Alu I，Cai I，Cfr I，Hinl I，Hinf I and Rsa I respectively．The observed homozygous genotypes at the six loci were utilized to tentatively identify the homozygous birds of B—L B II allele genes．and seven homozygous ge