4.免疫电镜细胞化学技术.pptVIP

免疫电镜细胞化学技术;电镜细胞化学技术; 免疫电镜技术; 目前免疫电镜技术主要包括酶免疫电镜技术，免疫铁蛋白技术和免疫胶体金技术，此外还有抗体杂交技术、凝集素电镜标记技术和铁蛋白-抗铁蛋白电镜复合物技术。 用以标记抗体的酶要具备以下条件： 1.与抗体（或抗原）结合后，仍能保持酶和抗体（或抗原）的生物活性。 2.酶的纯度高、特异性强、稳定、可溶性好、敏感、廉价。 3.在体液或组织中不存在该酶的底物。 酶标技术中最常用的标记酶是辣根过氧化物酶（HRP）;电镜免疫细胞化学技术的标本处理原则;;三、免疫染色;2.免疫染色;;;2、胶体金的特性 ①颜色：胶体金的颜色与金粒子的直径有关，5-60nm时为红色，95nm是为蓝色，用于免疫细胞化学的胶体金呈红葡萄酒色。 ②影响胶体金稳定的因素： a.电解质：少量有促进稳定的作用，过量则破坏。 b.胶体金的浓度：浓度越高容易导致胶体金凝集。 c.温度：长时间加热可使稳定性有所下降。; 檬酸三钠的用量与胶体金直径的关系; 鞣酸-柠檬酸钠还原法制备不同大小胶体金颗粒的配方;优点： ①胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显的变化。 ②金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒清晰可辨，易精确定位。;;;;（3）电镜包埋后免疫金染色法 ;;2.电镜免疫金染色 用于电镜的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后染色，可根据抗原的性质加以选择。 染色方法也有直接法和间接法。;;双标记菌毛上两种抗原，胶体金5nm, 20nm;图7-11 血小板表面胶体金标记GPIb单抗 ×9000;铁蛋白标记电镜免疫细胞化学技术;基本原理： 铁蛋白是一种直径10～12nm的球形的蛋白质（分子量450kD）,它含有致密的铁胶粒核心（直径约7.5nm），该核心含2000～5000个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，因此可用于电镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联剂形成抗体-铁蛋白复合物，此复合物既保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶粒核心，便于电镜观察。 ; 病毒免疫电??技术;5. 影响因素：; ;1、标本－染液混合染色法：; 2、琼脂扩散技术： 检测的材料中病毒含量不足时，为了达到浓缩病毒的目的，并去除材料中所含盐分，可采用琼脂扩散法。 用0.8%琼脂铺好的琼脂块，把含病毒的悬液滴到琼脂块上，然后把载网倒悬在这滴悬液上。琼脂块把水分吸收，浓缩的病毒沾附在载网上，再经过负染色后进行电镜观察。;3、假复型技术：;方法：;4、病毒颗粒免疫电镜技术：;样品制备步骤：;根据抗体凝聚的病毒颗粒的多少和程度以（+）表示。 如果检查不到抗体包被的病毒颗粒，可离心，将沉淀重悬浮于1-2滴蒸馏水中，再用同样方法滴膜、负染。 利用免疫电镜技术发现和鉴定了许多重要的病毒。;INSERT THE TITLE OF YOUR PRESENTATION HERE ;Free PPT Templates - Widescreen(16:9);Click to add title;INSERT THE TITLE OF YOUR PRESENTATION HERE ;Free PPT Templates - Widescreen(16:9);Click to add title