§2.2-双波长和三波长分光光度法解析.pptVIP

第二节 双波长和三波长分光光度法 一．双波长分光光度法的原理 双波长分光光度法是在传统的单波长分光度法的基础上发展起来的。单波长分光光度法要求式样本身透明，不能有混浊，如果是试样溶液在测量过程中逐渐产生浑浊便无法正确测定。对于吸收峰相互重叠的组分或背景很深的试样分析，也很难得到准确的结果。 双波长分光光度法的建立，在一定程度上克服了单波长法的局限性，扩展了分光光度法的应用范围，在选择性、灵敏度和测量精密度等方面都比单波长法有进一步的改善和提高。 * * 1．基本原理 对于混浊试样或成分复杂、背景吸收较大的试样，采用经典的分光光度法就难以找到合适的参比溶液来消除其干扰。若采用双波长分光光度法，将λ2选择在被测组分的最大吸收波长处，λ1选择在基本无吸收的波长处，这样可以从分析波长的信号中减去参比波长的信号，消除了干扰，大大提高了方法的选择性和灵敏度。 单组分的分析 测定波长λ2和λ1通常选用被测组分的最大吸收波长和等吸光点波长进行测定。若无等吸光点或等吸光点无法准确确定，可以选用被测组分的最大吸收波长和该组分吸收光谱曲线下端的某一波长作为测定波长。 (2) 双组分中某一组分的分析 试样中含有A、B两组分，组分B干扰组分A的测定。若采用双波长分光光度法，可不分离B而直接测定A的含量。 等吸光度波长法 为了消除干扰组分B的吸收，分析波长λ1选择在组分A的最大吸收峰或它的附近，参比波长λ2用作图法确定，如下图所示。在组分A的λ2处作一垂直于X坐标的直线，该直线与干扰组分B 相交于某一点，再从这点作平行于X坐标的直线并与组分B的吸收曲线相交于一点或几点，与该交点相对应的波长作为参比波长，如图中的λ1或λ?1。所选择的λ2和λ1应符合以下条件：第一，干扰组分在该两波长处的吸光度相同；第二，被测组分在该两波长处的吸光度差A要足够大。由吸光度加和性知，混合试样在λ2和λ1处的吸光度可表示为： 双波长分光光度计的输出信号为△A： 合并以上三式 因 所以 该式表明，此时测得的 ?A与干扰组分无关。 (b) 系数倍率法 当干扰组分B的吸收光谱曲线无吸收峰，仅出现陡坡，不存在吸光度相等的两个不同波长，如下图所示。在这种情况下，采用系数倍率法。利用双波长分光光度计本身的电子线路，选择被测组分吸收差值大的波长进行测定。用差分放大器可获得混合试样在波长λ2和λ1处的差示信号S： 式中，K2和K1分别为在λ2和λ1处的放大系数；组分A和B在λ2和 λ-1处的吸光度分别为 调节仪器中的信号放大器，使干扰组分B在波长λ2 和λ1处的信号相等，由此得系数倍率K为： 则上式为： 该式表明，干扰组分消除，信号S与被测组分的吸光度值有关，从而可以测定其含量。 2. 双波长分光光度计 双波长分光光度计采用两个单色器，如图所示。光源的光束经两个单色器后分别产生波长为 λ1和λ2的两单色光，由切光器使两单色光以一定的时间间隔交替通过同一吸收池，并被光电倍增管交替接收，测得吸光度差?A。当光强度为Io的两单色光λ1和 λ2交替通过同一吸收池时，根据比耳定律，对λ1波长： 双波长分光光度计光路示意图 1. 光源，2、3 . 两个单色器，4 . 斩光器，5 . 样品池，6 . 光电倍增管。 对λ2波长： 式中，△As1和△As2为背景吸收，若λ1和λ2很相近，可视为相等。因此通过吸收池后的光强度差为： 式中，△As1和△As2为背景吸收，若λ1和λ2很相近，可视为相等。因此通过吸收池后的光强度差为： 该式表明，试样溶液中被测组分的浓度与两个波长λ1和λ2处的吸光度差 △A成比例，这是双波长法的定量依据。 双波长分光光度计既可作为双波长的方式，也可作为单波长双光束的方式工作。 双波长光光度计不仅可测定多组分混合试样、混浊试样，而且还可测得导数吸收光谱。测量时使用同一吸收池，不用空白溶液作参比，消除了参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差。此外，使用同一光源来获得两束单色光，减小了由光源电压变化而产生的误差，因此，灵敏度高。 3．双波长分光光度法的特点 双波长分光光度法的特点具有如下的特点： ? 可进行浑浊试样的分析。 ? 通过适当的波长组合，可进行双组合或三组合混合物的同时测定。 ? 当波长相差1~2nm时，使双波长同时扫描，可记录一阶导数光谱。 ? 采用一波长固定，另一波长扫描，记录吸收光谱。可消除浑浊背景的影响。 ? 采用双笔记录器，可记录溶液中发生的两种现象。 从原理上讲，单波长法（单光束和双光束）和双波长法的不同之处