基因工程第四节-工具酶.pptVIP

Chapter Four  Manipulative Enzymes 核酸酶：指通过切割相邻的两个核苷酸之间的3－5磷酸二酯键，而引发核酸分子发生水解断裂的酶。按水解断裂核酸分子的方式不同，分为核酸内切酶和外切酶。 核酸外切酶：从核酸分子的末端开始，一个核苷酸，一个核苷酸地消化降解多核苷酸的酶。 核酸内切酶：从核酸分子的内部，切割磷酸二酯键使之断裂并形成小分子片断的酶。 限制性内切酶是核酸内切酶的一种。 一、限制性内切酶的发现与种类： 1、限制性内切酶的发现： 20世纪60年代在研究细菌的限制和修饰现象时被Linn和Arber发现，他们研究的是大肠杆菌。大肠杆菌细胞可以降解噬菌体的DNA入侵，也就是在生物体可识别外源DNA，并将其降解，而保护自身的DNA不被感染。 这就是在生物体内普遍存在的限制修饰现象。限制是restriction,修饰modification,所以书上把这一系统叫做：R/M体系。 限制与修饰是由两种酶引起的，一种是甲基转移酶，一种是核酸内切酶。 核酸有四个碱基，碱基排列有44个排列顺序，内切酶具有识别位点，他的限制性体现在可以识别这些位点，并进行切割，这样外源的DNA即使进入生物细胞，也可以被降解，这就是限制;修饰是由甲基化酶来完成的。在生物内部有甲基化酶，他们可以催化甲基从给体分子S－酰苷甲硫氨酸转移给可识别的序列（内切酶），使之甲基化，这样内切酶无法识别甲基化的序列，就不能进行切割，从而保全了自身的DNA。 限制与修饰存在两方面的作用：一是保护自身的DNA不受限制，即不被切割；二是破坏外源DNA使之迅速降解。 如果没有限制修饰，DNA、基因到处都是，顺利进入任何生物,改变遗传物质，发生变异。 2. 限制性内切酶的种类： 有三种不同类型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型 Ⅱ型：其内切酶活性和甲基化活性是分开的，只负责限制，因此叫限制性内切酶。修饰由独立的甲基酶完成。 而且核酸内切作用具有序列的特异性，可识别回文序列，－AGCT-，便于操作，广泛应用。 特点： 限制性内切酶在识别序列后，对双链DNA进行切割，双链锻裂后，形成特定的酶切末端，叫“粘性末端”。粘性末端有三种形式： 5”突出粘端：EcoRI切点 5---G AATTC---3 3---CTTAA G---5 3”突出粘端：PstI切割位点 5---CTGCA G ---3 3---G ACGTC ---5 平端： SmaI 切割位点 5---CCC GGG ---3 3---GGG CCC---5 二、限制性片断末端的连接作用: DNA片断经限制性内切酶切割后，可自然的重新连接起来，或环化起来； 不同DNA片断通过互不的粘性末端之间的碱基配对而彼此相连接，称之为分子间连接。 同一DNA片断通过互不的粘性末端的碱基配对连接成环状形分子， 称为分子内连接。 对重新连接的DNA片断经加热处理后，会重新线性化； 如果对连接或环化的分子用连接酶处理，形成的DNA分子就是永久性的。 限制性内切酶识别的靶序列同DNA的来源无关，也就是说不带有种的特异性，对各种DNA都普遍适用。无论那种生物的DNA经同一种酶作用切割后，形成的片断都能连接再一起，来实现DNA重组。 三、限制性内切酶的命名: 1973年，Smith和 Nathans提出了一个较系统的命名原则： 四、影响酶活性的因素： 1、靶DNA的纯度：内切酶的消化底物的速率很大程度上取决于使用的DNA样品本身的纯度。通常我们从生物样品中提取出的DNA容液中，含有许多物质，如蛋白质，多糖，酚、氯仿，酒精、乙二胺四乙酸（EDTA）,SDS（十二烷基磺酸纳），高浓度的盐离子。这些都是酶活性的钝化剂。酚的影响最大，他可以使蛋白质变性，使酶失活。 消除办法： 尽量保证DNA纯度达到最大。酚抽提去蛋白；醇抽提（氯仿、异戊醇的抽提）去酚，去多糖；乙醇抽提去多元醇；沉淀（蛋白也沉，但DNA和蛋白能看的出来）；干燥去乙醇。 增加酶的用量，平均每ug底物DNA的用量可达10个单位或更多。但有一个问题：商品化的酶均加入50％的甘油作为保护剂，在－20度保藏不会结冻。如果加入酶量过大，甘油浓度过高，会抑制酶活性。 2、DNA的甲基化程度： 核酸内切酶是原核生物限制修饰的组成部分，因此，识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会强烈的影响酶的活性，造成DNA只能被局部消化。为了避