基因转化方法与转基因植株鉴定全.pptxVIP

基因转化方法与转基因 植株鉴定;遗传转化的主要方法 农杆菌介导的遗传转化 基因枪法 电击法 注射法 化学药剂诱导转化 花粉管通道法 ;一、农杆菌介导的基因导入(植物细胞) Transferring genes into plant cells by cointegration using T-DNA，Ti plasmids，and agrobacterium;转化步骤可简单概括为以下方面： 1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。  2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。  3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。  4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定（这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见第五步） 几种方法进行检验（根据要求选取不同方法）。  5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。;技术特点： 转化拷贝数低 携带目的基因片段大 整合后外源基因结构变异小 操作简便等优点 该技术已成为转化成功最多的一种转化方法;基因枪法(particle gun) 又称微弹轰击法(microprojectile bombardment或 particle bombardment) 。 该法借助高速运动的金属粒子将附着于其表面的核酸分子引入受体细胞，外源基因进入受体细胞核后整合到染色体组，然后通过组织培养再生出完整个体(植株)。;程序与方法：;优点： 受体材料来源广泛 靶受体类型广泛 缩短了转基因周期、转基因植株变异率低 及通常具有正常的育性 缺点： 转化效率不高 多拷贝插入 费用较高 ;;基因导入方法: 三、电击法 (Gene transfer by electroporation) ;优点： 不受宿主限制 操作简便 对植物细胞不产生毒性 转化效率较高，特别适于瞬间表达 缺点： 易造成原生质体的损伤 存在原生质体再生困难 ;注射法 开始用于动物卵细胞，后来被用于植物。 用显微注射仪把外源DNA 溶液注入到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中产生高的压力及卵细胞的吸收，使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因植株。对于子房大、多胚珠的作物，可以说是一种简便可???的转化途径。;化学药剂诱导转化 常用的化学诱导剂： 聚乙二醇(PEG) 多聚鸟氨酸(PLO) 聚乙烯醇(PVA) ;优点： 不受宿主范围的限制 操作简便 成本底 缺点： 一般只适用于原生质体的转化，而原生质体再生植株并不容易，转化效率低; 再生植株常不可育或形态异常、多拷贝插入等现象。 ;四、花粉管通道法;花粉管通道法 步骤： １）去除花冠; ２）用微量注射器从断面沿花柱中轴插入子房长度的约１／４处，再退回２毫米左右; ３）注入含外源目的基因的缓冲液; ４）正常管理，收获种子, 经筛选获得转基因植株。;技术特点： 直接、简便易行; 不需要组织培养的继代，从而排除了植株再生的障碍； 但转化效率较低； 适合于花器官较大的植物。 该方法可用于任何开花植物，将供体总DNA的片断，在受体自花授粉后一定时期涂抹于柱头上，使能沿着花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后的细胞。实际应用时一般切除柱头进行涂抹，这样可减少DNA 进入胚囊的距离，提高转化率，但会影响结实率。 ;转基因植物的鉴定;转基因植物的鉴定;检测拷贝数;Southern blot 制作探针： ----- 根据试剂盒的要求确定DNA用量， 一般不超过100ng. ------ 反应结束后对探针最好用层析柱进 行纯化 ; -----不同的植物用于Southern杂交的DNA量不同，一般每泳道的拟南芥DNA的用量为10-25ug. -----一般用高于酶切需要量DNA的10倍酶量，DNA的浓度不要过高。注意不同的酶要求的反应温度不一样。 -----酶切后取少量样品检测酶切是否完全，如果不完全，可加酶后继续酶切。;;一般用尼龙莫 一般实验室多采用毛细管法 转膜缓冲液一般为10X的SSC或SSPE, 转膜时间一般为48hr。用UV确认转膜是否完全。 固定： UV 0.4M NaOH, 80oC烘烤1.5-2小时;二、 Northern blot;-----电泳槽用5%过氧化氢处理2个小时以上，DEPC处理水清洗2次。 -----灭菌、RNA专用瓶中加入80mlDEPC处理水及1.2克琼脂糖，微波炉加热溶解，60oC水浴上放置15分钟，加入5ml20xMOPS及15ml甲醛溶液，灌胶。与通风橱中进行。; ----RNA加样缓冲液：