CaCl2感受细胞的制备的实验步骤.docVIP

CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤 1．前夜接种受体菌（ DH5α或 DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）； 2．取 1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）； 3．将 0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷； 以下步骤需在超净工作台和冰上操作 4．吸取 1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5．4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6．弃去上清，加入 100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； 7．4℃下3000g冷冻离心5分钟； 8．弃去上清，加入 100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（ 15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。 ·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 1．前夜接种受体菌（ DH5α或 DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜； 2．取 2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）； 3．将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作 4．吸取 1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5．4℃下3000g冷冻离心5分钟； 6．弃去上清，加入 1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 7．4℃下3000g冷冻离心5分钟 8．弃去上清，加入 750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 9．4℃下3000g冷冻离心5分钟 10．加入 20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 11．立即使用或迅速置于 -70℃超低温保存。 附注： 影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项： 1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml ）； 2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3．经 CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加， 24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； 4．化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或 Co2+ ）、 DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）； 5．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 HYPERLINK http://51/DNA/index.html DNA ； 7．一定范围内，转化效率与外源 HYPERLINK http://51/DNA/index.html DNA 的浓度呈正比； 感受态细胞转化效率的检验 为确定感受态细胞的转化效率，可将一定量的完整质粒转化到感受态细胞中，取一部分转化的细菌，涂布到选择培养基上，可用菌落生长单位/μg DNA，按下面的方法计算感受态细胞的转化效率.计算公式：转化效率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量。例如，取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞. 向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板.培养过夜，产生1000个菌落。转化0.1 ng DNA，用SOC稀释到1000μl后，取1/10涂平板，则涂平板共用0.01 ng DNA 质粒，所以转化率＝1000克隆/0.01 ng DNA =105 cfu/ng=108 cfu/μg.转化效率1×106 cfu/μg DNA可满足普通的亚克隆实验；1×107 cfu/μg DNA用于作更复杂的亚克隆，有限量的DNA的转化，T-克隆实验；构建文库和突变要求用的转化的效率为1×108 cfu/μg DNA 高效感受态细胞制备 方法一：　　效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。实验试剂：A液：1M，MnCl2： B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌； C液 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶