TCT沉染色实验记录.docVIP

实验日期:2012/12/25 PAGE PAGE 2 实验记录 实验目的 熟练掌握TCT机器及手工操作过程。 实验器材、试剂 器材：全自动TCT制片仪、震荡器、旋涡混合器、低速水平式离心机、移液抢、15mL离心管、15mL过滤器、3mL吸管、真空泵、试管架、载玻片、盖玻片、玻片架、染色槽、记号笔、2B铅笔、量筒、试剂瓶、恒温干燥箱、滴定管、TCT专用吸嘴、定时器、吸水纸、光学显微镜 试剂：梯度离心液、细胞固定保存液、100×缓冲液、异丙醇、无水乙醇、二甲苯、84消毒液、纯水（蒸馏水）、苏木素、EA/OG、95%乙醇、75%乙醇 配制试剂 缓冲液：100×缓冲液用纯水1:99稀释。 冲洗液：异丙醇和无水乙醇1:1混合 废液针清洗液：84和纯化水1:20混合 四、实验步骤 将装有样本的细胞固定保存液瓶编号如下： 实验编号 1 2 3 4 5 样本号7364729340259264取样本体积 1mL 2mL 3 mL 2mL 4mL 在离心管上用记号笔写编号如下： 日期 2012.12.25 2012.12.25 2012.12.25 2012.12.25 2012.12.25 实验编号 1 2 3 4 5 取样本体积 1mL 2mL 3 mL 2mL 4mL 在笔记本上记录如下： 日期 2012.12.25 2012.12.25 2012.12.25 2012.12.25 2012.12.25 实验编号 1 2 3 4 5 样本号7364729340259264操作类型 上机 上机 上机 上机 手工 取样本体积 1mL 2mL 3 mL 2mL 4mL 将标本瓶放在震荡器上振荡30秒，使其充分混匀。 在离心管中加入4mL梯度离心液，用移液枪通过过滤器，加入对应体积的细胞保存液。 取下过滤器丢掉。将离心管放入离心机中，以转速1080转2分钟，完成后取下离心管，用真空泵洗掉上面的液体，使离心管中剩下4mL液体，再放入离心机中，以转速2000转十分钟。取出离心管，倒掉上清液。 （1）上机的离心管，直接把底部接触漩涡混合器，混合30s。（此次未进行操作，此为失误，导致细胞重叠） （2）手工的5号离心管，在离心管中加入500—800μL缓冲液。在混合器上震荡30秒，使底部的细胞呈悬浮状态（此次错加入冲洗液，为失误，导致染色失败） 在玻片上用铅笔写上： 日期 2012.12.25 2012.12.25 2012.12.25 2012.12.25 2012.12.25 实验编号 1 2 3 4 5 取样本体积 1mL 2mL 3 mL 2mL 4mL （1）上机操作：放入标本离心管、吸嘴、玻片、染色槽、把TCT仪左侧的H2O（缓冲液）、ALC（冲洗液）、HEMA（苏木素）、EA/OG管道插入对应的试剂瓶中。 （2）手工操作：在离心管取出300—500μL细胞保存液倒入已放好的染色槽中，沉降十分钟 （1）上机的离心管：开机，开电源—机器自检，进入参数设置界面—左右键选择标本数4—按设置建选程序—按充管键充管—完成充管后，按设置键返回—按运行键，自动运行。 （2）手工的离心管：沉降完后，倒掉上清液。加入冲洗液两次（第一次直接倒掉第二次过3—5s倒掉可1次时间放长些再倒掉）。加苏木素2分钟，2次缓冲液，1次冲洗液，冲尽残液。加EA/OG，2分钟，两次冲洗。 上机的离心管运行完，按设置返回。然后，上机和手工都是取下染色槽，拿出玻片，用玻片架将玻片放入2缸95%酒精、2缸无水乙醇中，进行震洗。 干封：用恒温干燥箱、烘箱、或吹风机 用中性树胶、盖玻片封片。 湿封：过二甲苯 显微镜观察（清晰度、染色深浅、有无杂质、粘液，胞浆、胞核区分清楚，细胞数量，主要观察中层细胞,中层细胞是蓝色,上层细胞是红色,肿瘤细胞的胞核比正常细胞的大）。 清洗机器：（1）按排管键排管 （2）按照显示屏提示，将管道从苏木素（HEMA）、EA/OG中取出放入对应的清洗液：纯水和75%乙醇中，按运行。完成后，取出管道放入空瓶中，按运行。 （3）装上清洗槽，倒入废液针清洗液，按运行键，浸泡一分钟后自动吸干。倒入纯化水，按运行键。 （4）按设置键返回，取下清洗槽，关电源。 五、实验结果