物质的提取和鉴定.doc

物质的提取 质粒DNA的提取 实验原理：质粒是存在于染色体外、能独立复制的双链闭合的环状DNA分子，以超螺旋的形式存在。在高pH值得NaOH和SDS溶液中，细菌细胞壁破裂，蛋白质和DNA发生变性。当加入中和溶液后，变性的染色体DNA与蛋白质缠绕形成大型复合体，被SDS包盖，当K 取代Na 时，这些复合体会沉淀下来；而质粒DNA双链能够迅速复性，呈溶解状态，留在上清液中。在上清液中加入乙醇，通过离心就可使质粒DNA沉淀下来。 实验步骤 1.取1.5ml菌液，室温下，12 000rpm，离心30秒。 2.弃上清，留沉淀，加入150μl冰预冷的溶液I（已加入RNase A），剧烈震荡，重悬沉淀。 3.加入150μl新配置的溶液II，快速颠倒混匀5次（注意：切勿震荡！），置于冰上。 4.加入200μl冰预冷的溶液III，反复颠倒数次混匀，冰浴5分钟。室温下，12 000rpm，离心5分钟。 5.取上清，转移到另一EP试管中，加等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），颠倒混匀有机相和水相，室温下，12 000rpm，离心5分钟。 6.将上清转移到另一EP试管中，加等体积氯仿：异戊醇（24:1），颠倒混匀，室温下，12 000rpm，离心2分钟。 7.将上清转移到另一EP试管中，加两倍体积冰预冷的无水乙醇，颠倒数次混匀，冰浴10~15分钟后，室温下，12 000rpm，离心15分钟。 8.弃上清，留沉淀，加1ml75%乙醇洗涤，12 000rpm，离心2分钟。 9.弃上清，室温下，12 000rpm，离心30s，吸除乙醇，室温干燥，使酒精充分挥发。 10.加20μl TE，溶解沉淀。 实验讨论 1.离心机需配平离心。 2.加入溶液III后，溶液中出现絮状物，可以多离心1分钟使溶液与絮状物分离更彻底。 3.加入的酚使蛋白质迅速变性，氯仿与异戊醇增强极性，纯化酚，同时进行有机抽提。 4.再次加入的氯仿与异戊醇为去除酚对实验后续产生的影响。 5.溶液I使沉淀重悬，其中Tris-Cl（pH8.0）为缓冲液；EDTA（pH8.0）为金属螯合剂，防止DNA酶作用；RNase A则降解RNA。 6.溶液II为实验提供碱性环境并裂解细胞。 7.溶液III中和溶液II并使质粒DNA复性；其中KAC与SDS结合后离子置换成钾盐，因其水溶性低可以后续去除。 8.质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一 种最常用的方法： 1）碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银 染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。 2、37℃振荡培养过夜。 取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管。 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中。 2）煮沸法 1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。 5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。 7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。 8、取20ml进行电泳检查。 质粒DNA的大量提取和纯化。 *在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒 DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 3）碱法 1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管 倒置使上清液全部流尽。 2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）