从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶.ppt

* * 组员：孙鹤、林哲闽、姜运秋、吴丽媛 一.材料的选择 因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸的物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验材料。 目的酶：由三种不同的亚基组成，为结合酶，pl=6.2 二.材料的处理 细胞破碎 机械破碎法 粗处理时可将肝脏用剪刀剪成小块 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波破碎法均可。 使用冻融法应注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。 化学破碎法：常用的化学试剂有：① 有机试剂② 表面活性剂③ 螯合剂等。他们都可以增加细胞膜的通透性，使酶容易释放。 2.防止蛋白酶的水解作用： 预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸） 3.除核酸： 一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需要大量的试验来选定，已知的有1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。 三.酶的提取 1.常用方法：盐析法 蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。 影响酶提取的主要因素： 酶在所使用溶剂中的溶解度； 酶向溶剂扩散的速度：酶向溶剂扩散的速度与温度（↗）、黏度（↘）、扩散面积（↗）、扩散距离（↘）及两相间的浓度差（↗）有密切关系； 温度：在不影响酶活性的条件下，适当提高温度，有利于酶的提取。适当提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散速度，但是温度过高，易引起酶的变性失活，所以提取时温度不宜过高。 pH值：提取时，溶液的pH值不宜过高或过低，以免引起酶的变性失活，并避开酶的等电点。当pH值等于某酶的等电点时，酶分子的溶解度最小。 提取液的体积：增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对进一步的分离纯化不利。因此，控制提取液的总量一般为原料体积的3～5倍。 盐析法之后要进行透析 四.酶的分离 常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤和膜分离法、萃取法等。 1.等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附件一定范围的pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。 2.离子交换柱层析法 酶提取液中含有目的酶以及其他杂质。可用柱层析法进行进一步的分离。 将交换剂缓冲液的ph调节到目的酶的PL与杂质蛋白的PL之间使其中一类蛋白吸附在交换剂或者虑过层析柱从而达到分离的目的。 五.酶的纯化、精制 1.结晶： 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。常用方法有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法 由于本实验目的产物为酶，故采用盐析结晶法。 原因：主要用于大分子如蛋白质、酶、多肽等的结晶。特点：不耐热，对pH变化及有机溶剂十分敏感。用中性盐作为沉淀剂，安全、操作简单。盐析结晶法操作包括：加固体盐法；饱和盐溶液；透析扩散法。 有机溶剂结晶法：针对小分子物质的结晶。 等电点结晶法：多用于一些两性物质。 2.浓缩： 从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来，在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、降低压力、增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。 3.干燥： 将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分，以获得含水分较少的固体物质的过程。 常用方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥等。 真空干燥：真空干燥是在与真空系统相连接的