发酵工程2(菌种选育)课件.ppt

2.原生质体融合育种 用脱壁酶（细菌和放线菌用溶菌酶，酵母和霉菌用蜗牛酶和纤维素酶）去除微生物的细胞壁，制成原生质体，用聚乙二醇促进原生质体融合，从而获得异核体的这一技术叫原生质体融合。 原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。 原生质体融合育种的特点 ① 杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。 ② 受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。 ③ 遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。 ④ 有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 ⑤ 提高菌株产量的潜力较大。 ⑥ 有助于建立工业微生物转化体系。 原生质体融合步骤： ①标记菌株的筛选:营养缺陷型和抗药性标记 ②原生质体的制备：脱壁酶脱壁 ③原生质体的融合：聚乙二醇促进融合 ④原生质体的再生：再生培养基培养再生壁 ⑤融合子的选择：选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 ⑥生产性能筛选。 ①标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。 ②原生质体的制备 在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。 影响原生质体制备的因素 1)菌体的前处理： 为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。 2)菌体的培养时间： 为了使细胞易于原生质体化，一般选择对数增殖期的菌体。 3)酶浓度： 对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。 另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。 4)酶处理温度 5)破壁时的pH值 6)渗透压稳定剂： 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。 ③原生质体融合 聚乙二醇（PEG）能有效促进融合。 由于细胞强烈脱水而使原生质体粘在一起，并形成聚合体。接触面积增大。细胞膜结构发生紊乱，加大细胞膜的流动性，原生质体相互融合。 PEG的使用浓度范围30~50%。 物理融合剂：电场、激光等。 ④融合体再生 融合体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构。 细菌再生率3~10%，真菌再生率20~80%，链霉菌再生率50%。若要获得较高再生率，应避免强力动作使之破裂。 原生质体悬液浓度不宜过高，因如有残存菌体存在，将首先长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。 菌龄、温度、溶菌酶用量和溶壁时间都会影响再生。 ⑤筛选优良性状融合重组子 来自两亲代的遗传物质经过重组而形成的子代称为融合重组子。 重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别，如两亲株为营养缺陷型A+B-和A+B-，融合重组子应是A+B+或A-B-。 直接法：将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子高渗再生培养基平板上，直接筛出原养型重组子。 间接法：把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。 原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生多种多样的基因组合，可得到多种类型的重组子。 还需进行生理生化测定及生产能力测定，以确定重组子是否缝合育种要求。 第三节 基因工程育种 一、基因工程育种的含义 基因工程育种是分子水平上的育种方法。根据需要，用人工的方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转移到受体细胞使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传形状。 二、基因工程育种的一般步骤 1.分离和纯化目的DNA片段 2.制备载体DNA片段：质粒、噬菌体 3.连接目的和载体DNA片段 4.转化连接有目的DNA片段的载体到受体菌；受体菌通常为大肠杆菌、酵母菌 5.工程菌的筛选 为什么霉菌和放线菌用孢子进行诱变处理？ 1.能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂； 2.它尽可能地避免出现表型延迟现象 表型延迟(Phenotypic lag)是指某一突变在 DNA复