第一章绪论(酶工程).pptVIP

第一章 绪 论 教学重点 :酶工程的概念、固定化酶活性测定、酶的生产方法。 讲授要点： 1、酶工程概念 2、酶工程发展概况 3、酶的基本知识（复习） 4、酶的生产方法 第四节??????酶的生产方法 人体内大多数酶的最适pH在6.5～8.0之间。 酶的最适pH不是酶的特征性常数。 pH对酶促反应速度的影响，其原因主要是由于pH的改变导致了酶的催化基团以及底物分子的解离状态改变或者导致了酶蛋白的变性。 四、酶的活力测定 在酶的生产及应用过程中，经常要进行酶的活力测定，以确定酶量的多少及其变化情况。 酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反应速度。反应速度越大，意味着酶活力越高。 酶催化反应速度，用单位时间内底物的减少量或产物的增加量表示。即：V=S/t或P/t 1、酶活力测定方法 酶活力测定方法多种多样。总的要求是快速、简便、准确。 酶活力测定均包括两个阶段。首先要在一定的条件下，酶与其作用底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物变化的量。一般采取如下步骤： （1）根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。 （2）根据酶的动力学性质，确定酶促反应的温度，pH值、底物浓度、激活剂浓度等条件。 （3）在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。 （4）反应到一定的时间，取出适量的反应液运用各种生化检测技术，测定产物的生产量或底物的减少量。为了准确地反映酶促反应的结果，应尽量采用快速、简便的方法，立即测出结果。若不能立即测出结果的，则要及时终止酶反应，然后再测定。 终止酶反应的方法很多，常用的有： ①反应时间一到，立即取出适量的反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活； ②立即加入适宜的酶变性剂，如三氯醋酸等，使酶变性失活； ③加入酸或碱溶液，使反应液的pH值迅速远离酶催化反应的最适pH，从而终止反应； ④将取出的反应液立即置于低温冰箱、冰粒堆或冰盐溶液中，使反应液的温度迅速降低至100C以下等等。 测定反应液中物质的变化量，可采用光学检测法，化学检测法等生化检测技术。 例如，用分光光度法测定碱性磷酸酶催化硝基酚磷酸水解生成的对硝基酚的量； 用化学滴定法测定糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄糖的量等等。 一种酶可能有多种测定方法，要根据实际情况选用。 2、酶活力单位 活力单位（active unit） 习惯单位（U）: 底物(或产物)变化量 / 单位时间 国际单位（IU）: 1μmoL变化量 / 分钟 Katal（Kat）：1moL变化量 / 秒 比活力= 总活力单位 总蛋白mg数 = U(或IU) mg蛋白 量度酶催化能力大小 量度酶纯度 比活力（specific activity） 3. 固定化酶的活力测定 与水不溶性载体结合，在一定的空间范围内起催化作用的酶称为固定化酶。固定化酶的性质与游离酶有一些区别。所以固定化酶的活力测定与游离酶活力测定方法也有一些不同。 常用的固定化酶测定方法： （1）振荡测定：称取一定重量的固定化酶，放在一定形状，一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液,在特定的条件下,一边振荡或搅拌,一边进行催化反应，经过一定时间，取出一定量的反应液进行测定。 固定化酶反应液的测定方法与游离酶反应液的测定方法完全相同，振荡或搅拌速度对反应速度有很大影响。过大过小都对反应速度有明显影响。所以，在测定固定化酶的活力时，要在一定的振荡或搅拌速度下进行。 （2）柱法测定：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中，让底物溶液以一定的速度流过酶柱，收集流出的反应液。按常规方法测定底物的消耗量或产物的生成量。测定方法与游离酶反应液的测定方法相同。 但在测定固定化酶活力要在固定的流速条件下进行。而且酶柱的形状和径高比都对反应速度有明显影响。所有 这些条件都必须固定不变。 （三）、共价催化 某些酶分子的催化基团可以通过共价键与底物分子结合形成不稳定的共价中间产物，这个中间产物极易变成过渡态，因而大大降低了活化能，使反应速度大为提高。这种催化称为共价催化（covalent catalysis)。 1、亲核催化（nucleophilic catalysis) 是指酶活性中心的亲核催化基团提供一对电子，与底物分子中的缺少电子具有部分正电荷的碳原子形成共价键，从而产生不稳定的共价中间物。 酶分子中可作为亲核基团 2、亲电子催化 是指酶活性中心上的亲电子催化基团从底物分子的亲核原子上争夺一对电子，形成共价键，从而产生不稳