利用荧光素酶报告基因技术在培养细胞以及爪蟾胚胎中研究-生物通.PDFVIP

利用荧光素酶报告基因技术在 培养细胞以及爪蟾胚胎中研究 Wnt信号转导 作者：韩家煜 清华大学生物科学与技术系细胞与发育生物学实验室北京市，100084 Wnt 家族蛋白参与控制从线虫到哺乳动物的一系列发育过程的重要事件，对生物体的组织动态 平衡也起到极为重要的作用。对于经典Wnt 信号通路（canonical Wnt pathway），当没有Wnt 蛋白时， 细胞质中的β-catenin 受降解复合体调控，导致β-catenin 被泛素标记，在蛋白酶体中降解。当存在Wnt 蛋白时，降解复合体活性受到抑制，β-catenin 降解减少，不再被降解，稳定后的β-catenin 将进入细胞 核，与转录因子LEF/TCF 结合，激活Wnt 信号下游特异靶基因的表达。 利用荧光素酶报告基因技术，我们可以在培养细胞以及爪蟾胚胎中利用特异性感应Wnt 信号的 报告基因质粒，将目的基因对于Wnt 信号通路的微观影响通过Thermo Luminoskan Ascent 仪器显 示为荧光素酶激活的信号强度，从而推测目的基因对于经典Wnt 信号通路的影响。 1 材料与方法 基 (Dulbecco’sModified Eagle Medium, Invitrogen)，3.7g NaHCO3, 硫酸链霉素、氨苄青 1.1 实验用主要质粒 霉素各 0.1g, 用 1M HCl 调 pH 至 7.2~7.6 之间。 (1) Wnt 信 号 通 路 相 关 蛋 白 LRP5/6, 使用滤膜过滤法除去细菌。 293T 细胞为贴壁生长 Frizzled, Rspondin，Disheveled 以及目的基因 型，细胞密度达到80~90%进行细胞传代。传代时， x9 构建在 pCS2+ 表达载体上。 使用胰酶消化细胞，37℃消化 1 分钟后吸取胰酶， (2) TOPFlash 质 粒 载 体。TOPFlash 加入 DMEM 培养液轻柔吹打细胞直至细胞分散 reporter 最早是由 Hans Clevers 实验室构建， 均匀，团块消失，随后根据实验需要 移取一定体积 除 了 含 有 一 段 荧 光 素 酶 报 告 基 因，还 包 括 的细胞悬浮液至新鲜的完全培养液中。细胞培养 TCF/LEF 结合位点，因而受β-catenin 转录活性 36 小时后，使用高效真核转染试剂 VigoFect 转 调控。我们使用的 TOPFlash 具有更高的信噪比， 染 HEK293T 细胞。转染前 1 小时，细胞密度达到 包 含 6 个 TCF/LEF 结 合 位 点（6 个 重 复 40%~60% 为宜， 并更换新鲜的完全培养液。转染 AGATCAAAGGgggta 序列拷贝）。与对照组 试剂的用量为：0.45ul 转染试剂 /1ugDNA, 使用 相比，报告基因可以被 Wnt 配体激活 100 倍左 相 同 体 积 的 生 理 盐 水 与 转 染 试 剂 充 分 混 合 右，而在持续性激活的β-catenin 作用下信号能 （Mixer），室温放置 5 分钟以上，随后将要转染的 够被激活 400 倍左右。 DNA 样品与 Mixer 充分混合，室温放置至少 15 (3) Renilla 质 粒 载 体。海 肾 荧 光 素 酶 分钟以后，将混合液体滴在细胞培养液中即可。如 (Renilla ren- iformis luciferase，简 称 Renilla 果转染时细胞密度低于 30%，转染后 4~6 小时更 luciferase)，更多地被用作转染效率的内参，以 换培养液。 消除细胞数量和转染效率的差异。 1.3. TOPFlash reporter assays 1.2. 细胞培养和转染 在 96 孔板中，我们除了转染需要研究的目 HEK293T 细胞培养在温度为 37℃，二氧化碳 的基因，同时共同转染 10ng/well TOPFash 质 浓度为 5% 的细胞培