分子生物学基本研究法.ppt

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分子生物学-第5章 第六章 分子生物学研究法 (下) 本章主要内容 基因表达研究技术 基因敲除技术 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片技术 其他分子生物学技术 SAGE是基因表达定性和定量研究的一种有效工具,非常适合于比较不同发育状态或疾病状态的生物基因表达。 另外SAGE能够接近完整地获得基因组表达信息,能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。 RNA原位杂交用放射性或非放射性(如地高辛 生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织 切片反应,若细胞中存在与探针互补的mRNA分 子,两者杂交产生双链RNA,可通过放射性标记 或经酶促免疫显色,对该基因的表达产物做出定 性定量分析。 4、基因定点突变(site-directed mutagenesis) 技术 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列。 常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响,也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。 寡核苷酸介导的DNA突变技术(P198图6-6) 以PCR为基础:重叠延伸技术(P199图6-7) 大引物诱变法(P200图6-8) 以上三种方法虽不同,但原理都一致。 PCR介导的基因定点突变方法的优势? 1、突变体回收率高。 2、能用双链DNA作为模板,可以在任何位 点引入突变。 3、可在同一试管中完成所有反应。 4、快速、简便。 6.2 基因敲除技术 P200 概念: 基因敲除技术(gene knockout)又称基因打 靶(gene targeting)。这种技术是通过基因工程 的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除, 或用其他序列相近的基因取代(又称基因敲 入),然后从整体上观察实验动物,从而推测相 应基因的功能。这种人为地把实验动物某一种有 功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。 基因敲除技术分为: 完全基因敲除:用同源重组法完全消除细胞或者动植物个体中的靶基因活性。 条件型基因敲除:用定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。 同源重组:是指发生在非姐妹染色单体之间或 同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或 分子之内的重新组合。 真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重 组基因载体,用电穿孔、显微注射等方法把重组 DNA导入胚胎干细胞纯系中,使外源DNA与胚胎干 细胞基因组中相应部分发生同源重组,将重组载 体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。 显微注射命中率较高,技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低,操作使用方便。 胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 1、酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system) 蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础. 酵母双杂交(yeast two hybrid) 技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用,该方法建立以来,经过不断的完善和发展,不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用,更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 酵母双杂交由Fields在1989 年提出。其产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。 GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 位于N 端1-174 位氨基酸残基区段的DNA 结合域(DNA binding domain,BD)和位于C 端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain,AD)。 BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应,但 是当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的 GAL4转录因子活性并可激活启动子,使启动子下 游基因得到转录. Fields 建立了一个双杂交系统,DB与X蛋白融 合,AD与Y蛋白融合,如果X、Y之间形成蛋白- 蛋白复合物,使GAL4 两个结构域重新构成,启 动特异基因序列的转录。 一般地,将DB-X 的融合蛋白称作诱饵(bait),X 往往是已知蛋白,AD-Y 称作猎物(prey),能显示 诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因,通过对 报告基因的检测,反过来可判断诱饵和猎物之间 是否存在相互作用。 正向选择基因neo的作用机理? 通常被插入到靶基因功能最关键的外显子中, 或通过同源重组置换靶基

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