昆虫病原线虫共生菌菌株R187杀虫毒素SI476的分离纯化、基因克隆与结构功能发现.pdfVIP

昆虫病原线虫共生菌菌株R187杀虫毒素蛋白S1476的分离纯化与活性研究及其基因突变株的构建 2结果与分析……………………………………………………………………35 2．1si476基因片断的扩增…………………………………………………35 2．2目的基因及质粒的双酶切……………………………………………．35 2．3重组菌株筛选…………………………………………………………．36 2．4表达蛋白的可溶性分析………………………………………………．37 2．5表达菌株诱导条件的优化……………………………………………．39 2．6亲和柱洗脱峰电泳检测………………………………………………．40 2．7融合蛋白His标签的切除……………………………………………．40 3讨论……………………………………………………………………………………………………．．4l 第四章沙雷氏菌R187金属蛋白酶si476突变株的构建…………………………．43 1材料和方法……………………………………………………………………43 1．1材料……………………………………………………………………………………………．43 1．2 2实验结果与讨论………………………………………………………………47 2．1si476s基因片断的扩增…………………………………………………47 KM．si476s的构建……………………………………．48 2．2重组质粒pUT 2．3si476s突变菌的PCR鉴定……………………………………………．50 2．4 KM．si476s突变菌发酵液的蛋白表达含量测定…………………50 pUT 2．5 KM．si476s杀虫毒力测定…………………………………………5l pUT 3本章小结………………………………………………………………………52 全文总结………………………………………………………………………………55 参考文献………………………………………………………………………………57 创新之处………………………………………………………………………………67 附录…………………………………………………………………………………68 致谢……………………………………………………………………………………………………………．69 摘要 离纯化、基因克隆及结构功能研究 摘要 昆虫病原线虫是当今热门的绿色生物农药，具有高效、安全、杀虫活性高等优点， 其中起杀虫作用的是昆虫病原线虫共生菌。病原线虫共生菌寄生于昆虫病原线虫肠道 本实验室从昆虫病原线虫新种如皋拟异小杆线，k--Heterorhabditidoides rugaoens西 分离出具有强效杀虫活性的共生菌菌株Serratia R187，该菌株主要杀虫 nematodiphila 活性成分为其分泌的胞外杀虫毒素蛋白。本文分离纯化了该菌株的杀虫毒素，并对其 进行基因克隆和功能鉴定研究。所用关键方法及取得的主要结果如下： FF离子交换层析、G75 ng·mg～。将发酵液粗提物冻干脱盐后利用DEAESepharose Resouce 分子筛和FPLC Q柱结合杀虫活性检测从中分离纯化到一个相对分子质量约 为55 (2．13．6．16)ng·mg～。 2．利用特异引物对菌株R187的毒素蛋白基因进行PCR扩增，该基因大小为 1450bp。构建表达载体pET．R187进行目的蛋白重组表达。最佳诱导条件为37℃、 0．1mmol·L～IPTG，3小时诱导，但并没有得到可溶性目的蛋白。表达蛋白完全以包 涵体形式存在，对包涵体进行复性，经过