分子克隆工具酶1.ppt

① 持续合成能力强 一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。 ② 3’?5’外切酶活性高 单链和双链都能降解。 ③ 不受DNA二级结构的影响 其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍。 T7 DNA聚合酶的特点 ② 进行末端标记 ① 以大分子量DNA为模板的合成 如M13 ③ 补平隐蔽末端 3’末端标记。 与T4 DNA聚合酶相同。 合成补平3’隐蔽末端； 水解修平3’突出末端。 用　途 T7DNA聚合酶的化学修饰 去除3’?5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。 修饰后的T7 DNA聚合酶的用途 ① DNA测序双脱氧法。 ② 标记DNA 3’隐蔽末端 ③ 更有效地补平末端 修饰后的T7 DNA聚合酶 基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链 反转录酶 Mg2+ dNTP 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTTTT 3’cDNA 2.3.5 反转录酶 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链 反转录酶 3’ RNA 5’ DNA 3’ 5’ 3’ RNA 5’ DNA 3’ 5’ 反转录酶 5’ DNA 3’ 基本特性 2.4 修饰酶类 在基因克隆技术中，除了限制酶、连接酶、聚合酶这些主要的工具酶外，还经常使用某些酶的相关功能对DNA或RNA进行分子修饰，以使操作更加巧妙、简便和高效。　 单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII） 大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ ExoVII 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 2.4.1 核酸酶 ExoVⅢ 3’ 5’ 3’ 5’ Mg2+ 3’ 5’ 3’ 5’ 大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3’端外切 双链核酸外切酶：核酸外切酶 Ⅲ（ExoⅢ） lExo Mg2+ Ⅰ核酸外切酶特异性地从5’端外切 3’ 5’ 3’ 5’ 双链核酸外切酶：Ⅰ核酸外切酶(ⅠExo) 3’ 5’ 3’ 5’ S1核酸酶的基本特性 单链核酸内切酶：S1核酸酶 来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae） 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍 Zn2+必需 最适pH范围为4.0~4.3 需要NaCl浓度10~300 mM 降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍 内切单链DNA或RNA 5’… G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’ S1 Zn2+ 5’… G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T… 3’ 5’… G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T… 3’ 5’dNMPs 或 5’NMPs 基本反应 内切带切口或缺口的双链DNA或RNA 5’… G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’… C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A… 5’ 5’… G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’ 3’… C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A… 5’ nick gap S1 Zn2+ 5’… G-C-T-C-A-G 3’… C-G-A-G-T-C T-G-G-A-G-T… 3’ A-C-C-T-C-A… 5’ 基本反应 在DNA上定位RNA（S1 mapping） DNA mRNA 杂交 S1 EcoRI 重要用途 基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana） Ca2+ 5’dNMPs 或 5’NMPs ssDNA or RNA Ca2+ Ca2+ 单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶 诱发DNA突变 EcoRI A B C EcoRI EcoRI B C A Bal31 B C A 环化 A C Bal31核酸酶的基本用途 来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP） 来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP） 5’p OH 3’ DNA or RNA 5’ppp dN 5’pppN BAP / CIP OH 3’ 5’ HO 5’HO dN 5’HO N 2.4.2 碱性磷酸单酯酶 功能：催化核酸脱5`-磷酸基团，使DNA或RNA片段5`-P末端转换成5`-OH末端。 5’p 3’HO OH 3’ p 5’ 碱性磷酸酶 5OH 3’HO OH 3’ OH 5’ 5’p 3’HO OH 3’ p 5’ 碱性磷酸酶 5OH 3’HO OH 3’ OH 5’ 碱性磷酸酶的活性 CIP的比活性比BAP的高出10～20倍 CIP在SDS中68℃就可完全失活 而BAP却是热抗性