分子生物学定点诱变与蛋白质工程课件.ppt

第九章 定点诱变与蛋白质工程;;;;一、定点诱变的概念;;二、基因定点诱变的意义;如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的丝氨酸(Ser221)邻近的甲硫氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。 枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的赖氨酸(Lys)取代位于活性中心166位的甘氨酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸谷氨酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点诱变改变蛋白质生物学活性的成功例子。 N端-----------笨丙-天冬-----------谷-甘-------------- C端 多肽链;三、定点诱变的原理;;定点诱变原理示意图;;; The Nobel Prize in Chemistry 1993 ;四、定点诱变的常用方法;（一）M13DNA寡核苷酸诱变;单链丝状噬菌体(M13噬菌体);1.基本原理：;;2.诱变过程;;（二）Kunkel定点诱变法;;基本原理： Kunkel定点诱变法是一种通过筛除含有尿嘧啶(U)的DNA模板链进行的寡核苷酸定点诱变法。它的基本原理是: 将待突变的基因克隆入RF- M13 DNA载体上，导入含有dUTP酶（dut）和N-尿嘧啶脱糖苷酶（ung）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株中。 (细胞内的dUTP酶能将细胞内的dUTP降解,使其含量减少; ung能将误入DNA新生链中的dUTP切除.在dut和ung双缺陷的大肠杆菌中,新合成的DNA链中含有U.) dut缺陷导致细胞内dUTP水平上升，并在DNA复制时，部分取代dTTP进入DNA新生链中。又由于ung缺陷使掺入DNA的dUTP残基不能除去。由这种大肠杆菌菌株产生的M13单链DNA大约有1%的T被U所取代，然后 以其为模板体外合成DNA的另一条链(不含U)，双链DNA导入正常的大肠杆菌中，其N-尿嘧啶脱糖苷酶切去DNA链上的尿嘧啶碱基。结果原来的M13模板链被降解。只有突变链因不含U，被保留下来。这种方法产生的M13噬菌体中含有突变DNA的比例大大增加。; Kunkel定点诱变示意图;（三） PCR定点诱变 ;PCR原理简介;;;;;;; PCR进行寡核苷酸 定点诱变的示意图 ;第二节 蛋白质工程;;;（一）蛋白质工程的概念 Protein Engineering;（二）蛋白质工程的理论基础;1.工、农业以及医药卫生事业的高速发展 为蛋白质工程的开展开拓了广阔应用前景;2.蛋白质结构与功能关系研究技术的建立推动了蛋白质结构与功能关系的研究，从而为蛋白质改造提供了理论依据;;;因此在对蛋白质进行改造之前必需对其结构与功能的关系进行充分地研究，了解影响蛋白质特性的氨基酸或氨基酸序列是哪些？改变这个（些）氨基酸是否会影响蛋白质的功能？因此阐明蛋白质的三维结构，进而研究其与生物学功能的关系已成为了解生命现象的关键，并成为蛋白质工程的基础。 蛋白质结构与功能关系研究技术主要包括蛋白质晶体学、蛋白质动力学、生物信息学等。;3.基因工程理论和技术的发展，为蛋白质的改造和生产提供了必要的技术手段;稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的相互作用，如肽键和侧链间的氢键、带有不同电菏的侧链间的静电作用、极性氨基酸残基侧链间的偶极作用、疏水残基间的疏水作用以及分子内的二硫键等。 蛋白质结构与功能研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰这些氨基酸残基，有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其生物学活性。 如野生型枯草杆菌蛋白酶的218位天冬酰胺(Asn)是酶活性部位有关的氨基酸残基，若将其变成丝氨酸(Ser)，用65℃的失活半衰期衡量，从59分钟增到223分钟，酶的稳定性显著增加。 再如氧化失活使枯草杆菌蛋白酶在工业上的应用受到严重限制。很早就有人证实枯草杆菌蛋白酶在少量H2O2作用下很快失活是由于埋藏在催化部位Ser221邻近的蛋氨酸(Met222)氧化成硫氢化物的原因。1985年Wells证明若用其他氨基酸取代Met222，可以提高酶的氧化稳定性而又保持高催化活性。;目前我们已经能对蛋白质的结构进行改造，甚至于能制造出全新的蛋白质，这得益于分子生物学理论与技术的发展。20世纪70年代初期，DNA重组技术诞生，并成功地应用于基因操作，从而产生了基因工程(73年)。而基因工程的诞生，特别是DNA重